原始肠内胚层细胞及其制作方法技术

本发明专利技术提供用于廉价稳定并且大量地诱导人器官细胞的基盘技术。也提供在使多能性干细胞分化之后，实施至少1次以上传代之后诱导的细胞，其中，作为未分化(多能性)细胞标志物的NANOG，OCT4，MYC，LIN28A是阴性，作为内胚层细胞标志物的CXCR4，CER1，HHEX，GATA4是阴性，作为肠内胚层细胞标志物的CDX2，HOXB9是阳性，再者，作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，可至少分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞的细胞。上述细胞的制作方法及扩增方法、使用上述细胞制作器官细胞的方法、冷冻－保存上述细胞，构建用于制造器官细胞的工作细胞库的方法。

Primitive intestinal endoderm cell and method for making the same

The present invention provides a substrate technique for inexpensive, stable, and large induction of human organ cells. After the stem cell differentiation can also provide implementation, at least after more than 1 passages induced cell, which is undifferentiated (pluripotency) cell markers NANOG, OCT4, MYC, LIN28A is negative, as endodermal cell markers CXCR4, CER1, HHEX, GATA4 is negative, as intestinal endoderm cell markers CDX2, HOXB9 is positive, moreover, as mesenchymal cell marker Brachyury (T) is negative, as pancreatic cell marker PDX1 was negative, can at least differentiate into liver cells and pancreatic cells and intestinal cells. The invention relates to a method for making cells and an amplifying method, a method for making organ cells by using the above cells, and a method for cryopreservation and preservation of the cells, and a method for constructing a working cell bank for making organ cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原始肠内胚层细胞及其制作方法
本专利技术涉及原始肠内胚层细胞及其制作方法，更具体而言，涉及能分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞的内胚层细胞及其制作方法。
技术介绍
近年，关注利用自iPS/ES细胞等的多能性干细胞诱导的组织－器官而开发新的药品的药物开发筛选或补救丧失的器官的功能的再生医疗实现化(Takebe，etal.Nature，499：481-484，2013(非专利文献1)、WO2013/047639：组织及器官的制作方法(专利文献1))。为了实现对于使用人iPS细胞的肝疾病的再生治疗，“超大量”的人肝细胞的GMP等级的制造技术变得必要。例如，为了使人成体肝脏的约30％的功能替代成为可能，对于1名患者，作为肝细胞数，移植6×1010个细胞植活是必须条件。一方面，对于这些超大量的人肝细胞制造，在通过由既有的现有技术的分化诱导流程尝试细胞调制时，如果考虑到移植效率，则1人的肝移植待机患者的治疗需要约95亿日元的莫大的成本，由我们的成本试算确证。【现有技术文献】【非专利文献】非专利文献1：Takebe，etal.Nature，499：481-484，2013【专利文献】专利文献1：WO2013/047639A1
技术实现思路
【专利技术要解决的技术课题】对于肝疾病的再生治疗费用的大部分是从人iPS细胞的分化诱导所要求的细胞因子等的分化诱导因子，所以以大幅的成本削减作为目的，作为在自人iPS细胞向器官细胞的分化过程中极重要的中间阶段，设定“原始肠内胚层细胞(PGECs)”被认为是极有利的战略。即，由分化诱导期间大幅缩短，每分化诱导的偏差最小化等，成为用于廉价稳定并且大量地诱导人器官细胞的技术基盘。作为解决这样的技术性障碍的方法，近年，尝试了以下的3个方法。(1)自iPS细胞诱导的内胚层前体细胞(CellStemCell.2012Apr6；10(4)：371-84.、WO2012178215A1)、(2)前肠内胚层细胞(StemCellReport，Vol1，293-306，2013)、(3)由直接重编程得到的多能性内胚层细胞(Nature508，93-97，2014)。是扩增由各(1)～(3)的方法制作的中间阶段的细胞，在功能细胞的分化诱导中使用的方法。但是，在(1)中，由于以小鼠细胞作为饲养者使用，难以临床应用。从在(2)中，从扩增的细胞诱导的细胞的分化功能显著地低，在(3)的方法中，扩增的细胞的安全性成为课题，即，确认CXCR4等的转移等的与癌的恶性度有关系的标志物表达等的问题来看，在各细胞中，难以在医疗－产业应用中使用是现状。本专利技术以解决这些现有技术的问题作为目的。【解决课题的技术方案】本专利技术人经锐意努力的结果，确立在上述(1)、(3)的细胞和(2)的细胞的中间阶段的“原始肠内胚层细胞(原始肠内胚层细胞：PGECs)”的诱导。再者，在使它们的细胞扩增之后，成功向功能细胞分化诱导。本专利技术的原始肠内胚层细胞(PGECs)能向肝细胞、胰腺细胞及肠细胞的分化(分化功能高)(对于上述(2)的细胞的显著性)、不表达CXCR4等的与癌的恶性度相关的标志物(安全性高)(对于上述(3)的细胞的显著性)、再者，由于可不使用饲养细胞调制，具有临床应用容易(对于上述(1)的细胞的显著性)的显著性。本专利技术的要点如下。(1)使多能性干细胞分化之后，在实施至少1次以上传代之后诱导的细胞，其中，作为未分化(多能性)细胞标志物的NANOG，OCT4，MYC，LIN28A是阴性，作为内胚层细胞标志物的CXCR4，CER1，HHEX，GATA4是阴性，作为肠内胚层细胞标志物的CDX2，HOXB9是阳性，再者，作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，所述细胞可至少分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞。(2)(1)所述的细胞的制作方法，其包括在第1阶段，在Rock抑制物的存在下，在第2阶段，在激活素A及Wnt3a的存在下，在第3阶段，在BMP4、bFGF、VEGF及激活素A的存在下，在第4阶段，在BMP4、bFGF、VEGF及激活素A的存在下，将多能性干细胞在饲养细胞非存在下培养而使分化之后，实施至少1次以上传代。(3)(1)所述的细胞的扩增方法，其包括传代后的第1阶段或传代初日在Rock抑制物的存在下，其后在SFD、FGF2、VEGF、EGF、A83-01及Chir99021的存在下培养。(4)器官细胞的制作方法，其包括使(1)所述的细胞向器官细胞分化诱导。(5)将(1)所述的细胞在任意的阶段冷冻－保存，构建用于制造器官细胞的工作细胞库的方法。【专利技术效果】从人iPS细胞将与分化中途阶段相当的PGECs在非饲养者环境下分化诱导变得可能。此PGECs能大量调制，可使用此细胞而制造器官原基(Takebe，etal.Nature，499：481-484，2013)。诱导的PGECs是在以往方法中必须的饲养细胞非存在下，也能进行20次以上传代培养而扩增至1010倍的细胞。再者，被扩增的细胞能由冷冻保存的贮存。再者，有向肝细胞、胰腺细胞、肠道细胞等的各种各样的功能细胞的分化能力的PGECs在重复在以往方法中成为课题的传代之后，也向有高的功能的功能细胞分化诱导。本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2014-248694的说明书及/或附图中记载的内容。【附图说明】【图1】显示人iPS细胞来源原始肠内胚层细胞(PGECs)的诱导－扩增－分化法的概要。由本专利技术扩增的细胞，相比称为定形内胚层或内胚层祖细胞的细胞，是作为(向肠道系统)分化的更下游的细胞的称为原始肠内胚层细胞(PGEC)的细胞。本细胞是能分化为来源于内胚层的全部的细胞的细胞。在细胞名(人iPSC/ESC，内胚层祖细胞(EP)/定形内胚层(DE)、PGECs)的下或右，记载该细胞表达的标志物的种类。【图2】显示从人iPS细胞未夹传代的PGEC的初期分化诱导过程和细胞的形态学观察。【图3】显示由Rock抑制剂的添加，进行传代时的细胞的粘接－植活大幅地改善。【图4】对于PGEC传代后的维持及增殖有效的细胞因子－添加因子组合的探讨。M1～8表示条件的差异。与图5的结果一并，显示M2的条件有效。【图5】左图显示在M1～8中的基因表达量的比较，右图显示细胞增殖数的定量结果。显示在细胞良好地增殖的M2，M4，M6～8的条件之中，作为PGEC标志物的CDX2表达增强，CXCR4，CER1的表达降低的条件是M2。【图6】显示对在传代第1～20次、及传代第5次的细胞的形态学变化进行显微镜观察的结果，长期继续传代之后也维持细胞的形态。【图7】在传代第10次中进行长期冷冻保存，解冻而继续细胞培养之后的形态观察的结果。显示解冻后重复传代20次之后也维持细胞的形态。【图8】显示人iPS细胞来源PGECs的增殖曲线(图8、左)和细胞倍增时间(图8、右)。【图9】显示在传代前(P0)及传代后(P5，10，15，20)的人iPS细胞来源PGEC标志物的表达基因的解析的结果。【图10】显示在传代前(P0)及传代后(P5，15)的人iPS细胞来源PGECs的FACS经时解析的结果。【图11】显示在传代前(P0)及传代后(P1，10，15)的人iPS细胞来源P本文档来自技高网...

【技术保护点】
细胞，其为在使多能性干细胞分化之后，实施至少1次以上传代之后诱导的细胞，其中作为未分化(多能性)细胞标志物的NANOG，OCT4，MYC，LIN28A是阴性，作为内胚层细胞标志物的CXCR4，CER1，HHEX，GATA4是阴性，作为肠内胚层细胞标志物的CDX2，HOXB9是阳性，此外，作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，且所述细胞至少可分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.09 JP 2014-2486941.细胞，其为在使多能性干细胞分化之后，实施至少1次以上传代之后诱导的细胞，其中作为未分化(多能性)细胞标志物的NANOG，OCT4，MYC，LIN28A是阴性，作为内胚层细胞标志物的CXCR4，CER1，HHEX，GATA4是阴性，作为肠内胚层细胞标志物的CDX2，HOXB9是阳性，此外，作为间充质细胞标志物的Brachyury(T)是阴性，作为胰腺细胞标志物的PDX1是阴性，且所述细胞至少可分化为肝细胞、胰腺细胞及肠细胞。2.权利要求1所述的细胞的制作方法，其包括：在第1阶段，在Rock抑制物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，谷口英树，张冉冉，
申请(专利权)人：公立大学法人横滨市立大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP