由多潜能干细胞进行的立体器官的构建制造技术

本发明专利技术解决在将功能细胞与源自脐带的血管内皮细胞及源白骨髓的间充质细胞共培养而由此构建立体结构(器官原基)的以往方法中，存在的[1]依赖于供体而质量存在较大的偏差，[2]细胞来源的增殖潜能有限，[3]由于来源不同而难以保证免疫相容性等问题。由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作的器官芽，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。器官芽的制作方法，包括将血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞在体外培养，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由多潜能干细胞进行的立体器官的构建
本专利技术涉及由多潜能干细胞进行的立体器官的构建。
技术介绍
已有报告本专利技术人至今开发了通过将在再生医疗等中使用的功能细胞(源自多潜能干细胞的器官细胞等)与源自脐带的血管内皮细胞，源自骨髓的间充质细胞混合，由此构建立体组织(器官原基)的方法，该器官原基在体外下的功能及对于疾病模型动物的治疗效果等方面优于利用平面培养诱导分化成的细胞(非专利文献1：Nature2013，非专利文献2：CellStemCell2015，专利文献1、2)。现有技术文献非专利文献非专利文献1：TakebeT等.，Nature499，pp481-484，2013非专利文献2：TakebeT等.，CellStemCell16，pp556-565，2015专利文献专利文献1：WO2013/047639专利文献2：WO2015/012158专利技术概述专利技术要解决的问题在使用2种源自脐带、骨髓细胞的以往方法中，[1]依赖于供体而质量会存在较大的偏差，[2]细胞来源的增殖潜能有限，[3]由于来源不同而难以保证免疫相容性等问题在实用上是绝对性的课题。另外，由于源自脐带、骨髓的细胞是成熟度高的细胞，因此对在器官原基的制作时所需要的未成熟细胞而言分化阶段大不相同，与生物体内的产生有较大距离。用于解决问题的方法本专利技术人通过将用于制作立体的器官原基而使用的3种细胞种类全部由人工多潜能干细胞(iPS细胞)制作，由此成功实现由分化阶段的同步的未成熟细胞制作器官原基。具体而言，对于根据源自iPS细胞的肝内胚层细胞和源自iPS细胞的血管内皮细胞和源自iPS细胞的间充质细胞的组合制作人肝芽，将作为以往方法的利用源自iPS细胞的肝内胚层细胞和源自脐带的血管内皮细胞，源自骨髓的间充质细胞的组合制作的人肝芽，进行了体外的白蛋白分泌能、分化标记的基因表达等的比较。其结果与以往方法相比，确认了大幅的功能改善。另外，将相当于6x106个的源自iPS细胞的肝内胚层细胞的肝芽移植到免疫缺陷动物(NOD/scid小鼠)中，结果发现，分泌到血清中的人白蛋白分泌量也得到了同样的结果。根据本专利技术，在追求大幅功能改善的同时，能够实现削减在品质评价及制造中涉及的成本及劳力。当取代iPS细胞而使用其它多潜能干细胞(例如：胚胎干细胞(ES细胞))的情况下，也可得到同样的效果的机率较高。本专利技术的要旨如下。(1)器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，上述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。(2)根据(1)所述的器官芽，其中，器官芽为能够通过成熟而分化为器官的结构体。(3)根据(1)或(2)所述的器官芽，其中，多潜能干细胞源自人。(4)根据(1)～(3)中任一项所述的器官芽，其中，多潜能干细胞为选自由人工多潜能干细胞及胚胎干细胞组成的组中的至少1种的细胞。(5)根据(1)～(4)中任一项所述的器官芽，其中，器官细胞为肝细胞，器官芽为肝芽。(6)根据(5)所述的器官芽，其中，肝细胞为TBX3阳性及ADRA1B阳性。(7)根据(1)～(6)中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为CD166阳性及CD31阴性。(8)根据(1)～(7)中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为LHX2阳性及WT1阳性。(9)根据(8)所述的器官芽，其中，间充质细胞的FOXF1，HLX1、COL4A及ALCAM的转录处于活化，间充质细胞为LHX2阳性、WT1阳性及MIIA阳性。(10)根据(1)～(9)中任一项所述的器官芽，其中，血管细胞为CD31阳性及CD144阳性。(11)根据(10)所述的器官芽，其中，血管细胞的选自由PECAM1、CDH5、KDR及CD34组成的组中的至少1个基因的表达高于诱导分化前的多潜能干细胞。(12)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。(13)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。(14)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。(15)根据(1)～(12)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。(16)根据(1)～(15)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的LHX2阳性及WT1阳性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。(17)根据(1)～(15)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD166阳性及CD31阴性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。(18)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。(19)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171130 JP 2017-2306471.器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。


2.根据权利要求1所述的器官芽，其中，器官芽为能够通过成熟而分化为器官的结构体。


3.根据权利要求1或2所述的器官芽，其中，多潜能干细胞源自人。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的器官芽，其中，多潜能干细胞为选自人工多潜能干细胞及胚胎干细胞中的至少1种的细胞。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的器官芽，其中，器官细胞为肝细胞，器官芽为肝芽。


6.根据权利要求5所述的器官芽，其中，肝细胞为TBX3阳性及ADRA1B阳性。


7.根据权利要求1～6中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为CD166阳性及CD31阴性。


8.根据权利要求1～7中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为LHX2阳性及WT1阳性。


9.根据权利要求8所述的器官芽，其中，间充质细胞的FOXF1，HLX1、COL4A及ALCAM的转录活化，间充质细胞为LHX2阳性、WT1阳性及MIIA阳性。


10.根据权利要求1～9中任一项所述的器官芽，其中，血管细胞为CD31阳性及CD144阳性。


11.根据权利要求10所述的器官芽，其中，血管细胞的选自PECAM1、CDH5、KDR及CD34中的至少1个基因的表达高于诱导分化前的多潜能干细胞。


12.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。


13.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。


14.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。


15.根据权利要求1～12中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。


16.根据权利要求1～15中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的LHX2阳性及WT1阳性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。


17.根据权利要求1～15中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD166阳性及CD31阴性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。


18.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。


19.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养。


20.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷口英树，武部贵则，关根圭辅，
申请(专利权)人：公立大学法人横滨市立大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP