哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟制造技术

本发明专利技术涉及用于哺乳动物辅助生殖技术的组合物和方法。特别地，本发明专利技术提供了用于未成熟卵丘卵母细胞复合体(COC)的体外成熟的组合物和方法，从而增强胚胎学结果。

The mammalian cumulus oocyte complex in vitro maturation

The present invention relates to compositions and methods for assisted reproductive techniques in mammals. In particular, the invention provides for immature cumulus oocyte complexes (COC) compositions and methods for in vitro maturation, thereby enhancing the embryology.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟专利
本专利技术一般性涉及用于哺乳动物辅助生殖技术的组合物和方法。具体地，本专利技术涉及用于哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的组合物和方法。专利技术背景在人类不育实践中，传统的体外受精(IVF)或胞质内精子注射(ICSI)技术在用昂贵的激素疗法进行超排卵后仍然使用，以获得大卵泡(即直径至少17mm)。激素的成本、其与急性和长期并发症相关的风险以及反复的医院就诊监测卵泡生长的不便，都会激励人们为正常/高卵泡储备的不育夫妇开发一种成本更低、耐受性更好的治疗方法。卵母细胞体外成熟(IVM)是一种技术，其可以使得封闭在牢固凝聚的冠状卵丘层中生发泡(GV)期卵母细胞(卵母细胞复合物(COC))成熟。可以在通过施用人绒毛膜促性腺激素(hCG)或hCG施用之后的早期触发排卵之前通过超声引导的针穿刺获得这些卵母细胞。因此，卵母细胞IVM有可能简化生育治疗或降低与正常卵巢卵泡储备或高卵巢卵泡储备患者激素(hCG)刺激相关的风险和成本。这种卵泡储备通常通过测量抗苗勒激素水平和通过月经周期的第3天超声引导的卵泡计数来确定。对于使用超声引导针穿刺的卵母细胞IVM，可以在最小刺激或未刺激的卵巢中从小(<10mm)卵泡中收集卵母细胞，并且体外成熟。然而，在发育的早期阶段干扰卵母细胞的正常发育(例如当卵泡仅达到10mm或更小的直径时)不仅产生较少的成熟卵母细胞，而且降低随后的胚胎发育和植入。特别是IVM后每个胚胎的成功植入率通常低于10％，只有常规IVF或ICSI程序的成功率的一半。早期流产的发生率似乎是可变的，但通常大于IVF/ICSI后的发生率。对于人类患者，目前降低的减数分裂成熟率(50％)与观察到成熟卵母细胞胚胎发育的缺陷一起是当前IVM技术的主要瓶颈(DeVosetal.,Fertil.Steril.2011；96(4)860-864；Guzmanetal.,Fertil.Steril.2012；98(2):503-507)。因此，在该方法可以广泛接受之前，需要解决IVM胚胎发育潜力和植入率的降低。IVM培养的基石是为获得发育能力提供适当的环境。这主要需要激素干预和激活必要的信号传导途径，通过使用允许卵母细胞内核细胞和细胞质成熟过程同步的化学化合物。体外延长卵母细胞成熟期的原理是促进未成熟卵母细胞与充分调节的卵丘细胞之间更长的相互作用。负责减数分裂阻滞的卵泡细胞和卵母细胞之间的信号传导途径已被广泛研究。通过产生高水平的环腺苷酸(cAMP)来维持减数分裂阻滞。通过降解cAMP的磷酸二酯酶(PDE)酶的活性调节卵母细胞内的cAMP浓度。最近的研究表明，cGMP在激活鸟苷酸-环化酶偶联的利尿钠肽2型受体(NPR2)后在卵丘细胞中产生。NPR2活性由其配体利尿钠肽前体C(NPPC)诱导，主要由壁颗粒细胞合成并切割成C型利尿钠肽(CNP)。然后将cGMP转移到卵母细胞中，其中它通过磷酸二酯酶PDE3A抑制cAMP的水解。这种抑制保持高浓度的cAMP，从而阻止减数分裂进展。(Tsafririetal.Dev.Biol.1996,178(2):393-402；Contietal.,Mol.Cell.Endocrinol.1998,145(1-2):9-14；Contietal.,Mol.Cell.Endocrinol.2002,187(1-2):153-159)。以前，为了促进卵母细胞减数分裂阻滞并允许获取卵母细胞能力，已经尝试了衍生自不同物种如小鼠、牛、人的体外成熟卵母细胞中cAMP水平的药理学干扰(Nogueiraetal.Biol.Reprod.2003,69(6):2045-2052；Thomasetal.Biol.Reprod.2004,71(4):1142-1149；Shuetal.Hum.Reprod.2008,23(3):504-513；Vanhoutteetal.Hum.Reprod.2009,24(3):658-669)。然而，在胚胎发育潜力水平方面没有报道重大改善。最近，CNP/NPR2信号传导途径已被证明是在中等大小和完全生长的卵泡中维持卵母细胞减数分裂阻滞的重要调节机制(Zhangetal.J.Cell.Physiol.2015,230(1):71-81；Satoetal.Mol.Endocrinol.2012,26:1158-1166,Franciosietal.Biol.Reprod.2014,91(3):61,Santiquetetal.Biol.Reprod.2014,91(1):16)。然而，上述研究中的主要问题是COC只能在减数分裂阻滞状态保持较短时间，因此，只有中等大小至答的卵泡的体外成熟才能成功，小的早期窦卵泡的成熟失败了。因此，延缓启动小的早期窦卵泡的减数分裂恢复以及为了改善IVM过程是目前的一个重大挑战。特别地，这样的操作方案不应影响进一步的体外成熟。对于这种小的早期窦卵泡，这种挑战甚至更高，因为它们需要获得或保持完成核成熟的能力(即从非包围核仁(NSN)变成包围核仁(SN)期)，然后进入下一步骤潜在发育，甚至保持卵母细胞和卵丘之间的互连，允许从卵丘中转移营养物质(例如RNA货物)。专利技术概述本专利技术涉及用于哺乳动物辅助生殖技术的组合物和方法。特别地，本专利技术提供了用于未成熟卵丘卵母细胞复合体(COC)的体外成熟的组合物和方法，从而增强胚胎学结果。在本专利技术的背景中，无需在先的hCG刺激或在hCG刺激之后，收集未成熟的哺乳动物COC。在优选的实施方案中，在体内收集COC之前避免任何触发剂，包括高剂量的FSH、LHRH及其激动剂，重组LH或LH类似物。在第一方面，本专利技术提供用于哺乳动物卵丘卵母细胞复合体(COC)的体外成熟的获能培养基，所述培养基包含0.1至50nMC型利尿钠肽(CNP)，雌二醇和FSH。在具体实施方案中，获能培养基包含10至25nMCNP，甚至更特别是25nMCNP。在具体实施方案中，获能培养基包含1至1000nM雌二醇，最优选10nM雌二醇。在另一实施方案中，获能培养基包含0.1至10mIU/mLFSH，特别是1至5mIU/mL的FSH，甚至更特别是2.5mIU/mL的FSH或1mIU/mL的FSH。在又一实施方案中，获能培养基包含25nMCNP，10nM雌二醇和2.5或1mIU/mLFSH。在又一方面，获能培养基包括等量剂量的重组FSH、FSH类似物或FSH模拟分子。在又一实施方案中，获能培养基包含0.1至10ng/ml胰岛素，特别是5ng/ml胰岛素。在另一方面，获能培养基包含等量剂量的胰岛素类似物或胰岛素模拟分子。在进一步的实施方案中，获能培养基包含卵母细胞分泌因子。本文所用的卵母细胞分泌因子选自GDF-9、BMP-15、FGF-8或其任何组合；特别是在获能培养基中的浓度各自分别为10至100ng/ml。在具体实施方案中，卵母细胞分泌因子是重组蛋白。在又一方面，卵母细胞分泌因子是异二聚体蛋白。在又一个另外的实施方案中，获能培养基包含0.1至50nMCNP，最优选25nMCNP；1至1000nM雌二醇，最优选10nM雌二醇；0.1至10mIU/mLFSH，最优选2.5mIU/mLFSH或1mIU/mLFSH；0.1至10ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于未成熟哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的获能培养基，该培养基包含0.1‑50nM C型利尿钠肽(CNP)、雌二醇和卵泡刺激素(FSH)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 EP 14199324.61.用于未成熟哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的获能培养基，该培养基包含0.1-50nMC型利尿钠肽(CNP)、雌二醇和卵泡刺激素(FSH)。2.根据权利要求1所述的获能培养基，其中所述培养基还包含0.1至10ng/ml胰岛素。3.根据权利要求1或2所述的获能培养基，其中所述培养基包含卵母细胞分泌因子；特别是选自GDF-9、BMP-15、FGF-8、它们的类似物或其任何组合。4.用于未成熟哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的方法，该方法包括将未成熟的卵丘卵母细胞复合体收集在收集培养基中，使哺乳动物卵丘卵母细胞复合体与根据权利要求1至3中任一项的获能培养基接触，并使哺乳动物卵丘卵母细胞复合体与成熟培养基进一步接触。5.根据权利要求4所述的方法，其中哺乳动物卵丘卵母细胞复合体与获能培养基接触最少2小时至最多96小时的时间段。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中哺乳动物卵丘卵母细胞复合体在非贴壁或贴壁培养板中、特别是在非贴壁培养板中与获能培养基接触。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中该方法是包括体外受精或ICSI的辅助生殖技术的一部分。8.用于未成熟哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求1至3中任一项所述的获能培养基。9.用于未成熟哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟的试剂盒，该试剂盒包含：(a)收集培养基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化学化合物或卵母细胞减数分裂的天然抑制剂；(b)根据权利要求1至3中任一项所述的获能培养基；(c)成熟培养基；(d)非贴...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·罗梅罗，F·桑切斯，J·史密兹，
申请(专利权)人：VRIJE布鲁塞尔大学，
类型：发明
国别省市：比利时,BE