一种中性蛋白酶及其基因和应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种中性蛋白酶及其基因和应用。本发明专利技术的中性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的中性蛋白酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了包含所述中性蛋白酶基因的重组载体，以及包含所述中性蛋白酶基因的重组菌株。本发明专利技术运用基因工程技术构建了含有中性蛋白酶基因的重组质粒，并在解淀粉芽孢杆菌中实现了中性蛋白酶的高效表达。构建的中性蛋白酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中性蛋白酶的能力，发酵液中酶活可达到9000U/ml。

Neutral protease, gene and application thereof

The invention belongs to the field of biological engineering, in particular, the invention relates to a neutral protease and a gene and an application thereof. The neutral protease of the invention, the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The neutral protease gene of the invention, the base sequence is shown as SEQ ID NO.2. The present invention also provides recombinant vectors comprising the neutral protease gene and recombinant strains comprising the neutral protease gene. The present invention constructs a recombinant plasmid containing neutral protease gene using gene engineering technology, and realizes the high expression of neutral protease in Bacillus cereus. The constructed recombinant strain of neutral protease has high application value and has high ability to produce neutral protease, and the enzyme activity in fermentation liquid can reach 9000U/ml.

【技术实现步骤摘要】
一种中性蛋白酶及其基因和应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体地，本专利技术涉及生物工程
，尤其是一种中性蛋白酶及其基因和应用。
技术介绍
蛋白酶是一类可水解蛋白质肽链的酶。中性蛋白酶属于其中一种内切酶，可水解处理各种蛋白质肽键，释放氨基酸或者多肽，其最适pH值为7.0左右。中性蛋白酶具有无工业污染、催化反应速度快、反应条件适应性宽等优点，因此在众多行业中都有应用，例如皮革、纺织、化工、食品、医药等，具有重要的工业价值。中性蛋白酶在动、植物，微生物中都广泛存在。而与其他来源相比，微生物来源的蛋白酶无论在培养条件、生产成本控制还是在制备规模上都有着极大的优势。其中以细菌蛋白酶居多，特别是芽胞杆菌属细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。近几十年来，随着科学技术的发展，酶的制备、酶分子改造等酶学技术飞速发展，中性蛋白酶的生产与应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国研究者一直都致力于中性蛋白酶的生产菌株筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用工作，并且取得了一定成绩。当前，我国中性蛋白酶的研究总体水平仍处于初级阶段，从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业并不是很多，而且采用的生产菌株大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不稳定、容易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定损失。近些年来随着基因工程技术的不断发展，人们开始借助基因工程改造来获得中性蛋白酶生产菌株。这些菌株具有产量高、生产周期短、成本低等优点。目前中性蛋白酶市场需求量比较大，但是现有中性蛋白酶生产菌株的生产水平有待提高，亟待研发出中性蛋白酶的高效表达菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中性蛋白酶及其基因、工程菌(重组菌株)和制备方法。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述中性蛋白酶的基因工程方法。本专利技术的另一目的提供上述中性蛋白酶及基因工程菌的应用。本专利技术从枯草芽孢杆菌CRVAB200(Bacillussubtilis)中分离得到一种新的中性蛋白酶。本专利技术提供了一种中性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：本专利技术的中性蛋白酶含532个氨基酸，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为50℃，在30-70℃之间相对酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有65％的剩余酶活；其最适pH值为7.0，在pH值6.5-8.0时，相对酶活达到将近80％。本专利技术还提供了编码上述中性蛋白酶的基因，具体地，该基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示：本专利技术通过PCR的方法分离克隆了所述中性蛋白酶的编码基因，DNA全序列分析结果表明，中性蛋白酶的编码基因全长1599bp。将中性蛋白酶的编码基因经序列比对后发现与GENBANKACCESSIONNumber为CP020102.1的中性蛋白酶基因相似度达98％，为一新的中性蛋白酶。本专利技术还提供了包含上述中性蛋白酶基因的重组载体，优选为包含上述中性蛋白酶基因的重组质粒pwB980。所述重组质粒pwB980还含有kan抗性基因、P43启动子序列、SPsacB信号肽序列、枯草芽孢杆菌终止子序列；本专利技术所述中性蛋白酶基因位于重组质粒pwB980的SPsacB信号肽序列和枯草芽孢杆菌终止子序列之间。本专利技术还提供了包含上述中性蛋白酶基因的重组菌株，优选所述重组菌株为解淀粉芽孢杆菌K1(Bacillusamyloliquefaciens)。本专利技术还提供了一种制备上述中性蛋白酶的方法，包括以下步骤：1)用上述包含本申请中性蛋白酶的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株使其发酵，诱导重组中性蛋白酶表达；3)回收并纯化所表达的中性蛋白酶。其中，优选所述宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌，优选将重组表达质粒转化解淀粉芽孢杆菌，得到重组菌株。所述发酵培养基可以为本领域公知的可以使用的任意培养基，优选为液体培养基，进一步优选地，液体培养基主要成分包括：20-40g/L的玉米粉，20-40g/L的豆饼粉，30-50g/L的麸皮，0.2-0.5g/L的磷酸二氢钾，3-5g/L的磷酸氢二钠，其余为水。所述发酵温度为29.5℃-35℃，优选30℃。本专利技术还提供了上述中性蛋白酶的应用。优选地，提供上述中性蛋白酶在饲料、食品、医药等工业领域中的应用，特别是在上述领域中降解蛋白的应用。本专利技术中的中性蛋白酶，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为50℃，在30-70℃之间相对酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有65％的剩余酶活；其最适pH值为7.0，在pH值6.5-8.0时，相对酶活达到将近80％。本专利技术的中性蛋白酶可应用于饲料、食品、医药等工业领域。本专利技术运用基因工程技术构建了含有中性蛋白酶基因的重组质粒，并在解淀粉芽孢杆菌中实现了中性蛋白酶的高效表达。构建的中性蛋白酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中性蛋白酶的能力，在同等发酵条件下，较野生菌酶活提高了近90％。附图说明图1为本专利技术实施例1中性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图，其中：1、为中性蛋白酶基因片段，2、为DNA分子量标准；图2为本专利技术重组质粒pwb980-npr结构示意图；图3为本专利技术重组中性蛋白酶最适温度；图4为本专利技术重组中性蛋白酶热稳定性；图5为本专利技术重组中性蛋白酶最适pH值；图6为本专利技术重组中性蛋白酶pH稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体表达载体pwB980购自于Invitrogen公司；枯草芽孢杆菌株168购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；解淀粉芽孢杆菌K1由土壤中分离。2、酶类及其它生化试剂酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1、中性蛋白酶基因的获得枯草芽孢杆菌CRVAB200是在水库附近采集的土壤样品中分离得到。具体为将土壤样品溶于无菌水中，经富集培养后取合适稀释梯度涂布于含1％脱脂牛奶的平板上，根据平板上透明圈的大小筛选得到。提取枯草芽孢杆菌CRVAB200(Bacillussubtilis)基因组DNA：(1)取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；(2)EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；(3)对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；(4)12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；(5)加RNaseA(25mg/mL)溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；(6)加结合液CB800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；(7)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；(8)加抑制物去除液IR500μL，12000rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中性蛋白酶，其特征在于，所述中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种中性蛋白酶，其特征在于，所述中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种中性蛋白酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的中性蛋白酶。3.根据权利要求2所述的中性蛋白酶基因，其特征在于，所述中性蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2或3所述中性蛋白酶基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为包含权利要求2或3所述中性蛋白酶基因的质粒pwB980。6.包含权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴培均，李富伟，张士彬，罗建杰，
申请(专利权)人：北京科为博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11