一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)诱变菌株及其诱变方法和应用，该菌株以高温发酵的堆肥中筛选出的产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉为出发菌株，经原生质体紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变后，筛选出的菌株再通过出芽孢子硫酸二乙酯‑微波复合诱变获得的。本发明专利技术的诱变菌株已于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。本发明专利技术中菌株诱变方法比常规诱变方法效率高，筛选过程简单快速，诱变菌株的生产能力更高，产量为嗜热拟青霉出发菌株产量的277.65％，发酵液酶活达到185U/ml，降低了生产成本，且该菌株生产的葡萄糖氧化酶耐高温、耐酸性好，可作为饲用酶应用于饲料行业。

Paecilomyces thermophilus mutation strain, mutation method and application thereof

The invention discloses a thermophilic Paecilomyces (Paecilomyces thermophila) mutation strain and mutation method and application of glucose oxidase of the strain with high temperature compost fermentation were screened for the production of high temperature resistant acid resistant thermophilic Paecilomyces strain by protoplast UV and ethyl methyl sulfonate compound mutation, screening the strain obtained by budding spore two ethyl sulfate microwave composite mutation. Mutant strain of the invention have preserved in general in November 11, 2016 China bacterial microbe preservation management committee, the preservation number is CGMCC No.13182. The mutation method in the invention efficiency than the conventional method of mutagenesis, screening process is simple and fast, mutant strains of higher production capacity, yield of thermophilic Paecilomyces strain yield reached 185U/ml 277.65%, the enzyme activity of fermented broth, reduces the production cost, the production of glucose oxidase and the strain of high temperature resistance, good acid resistance. Can be used as feed enzyme for feed industry.

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉及其筛选方法。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，简称GOD)是酶
中一种非常重要的酶，它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于其与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和食品工业生产上广泛的应用。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品或药品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；可脱掉食品中的氧，以达到改善食品品质、延长食品货架期的目的；同时，葡萄糖氧化酶凭其天然的优良特性,可作为一个较为理想的溴酸钾取代物，用作一种更为安全的面粉改良剂。在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物-葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。在医学诊断方面，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性,也被用于一些复杂生化体系中葡萄糖的定量测定，如快速检测血糖、尿糖。目前国内外己有许多葡萄糖氧化酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中通常对中温菌的产酶进行研究，而本专利技术嗜热拟青霉是一类能够在较高温度下正常生长代谢的微生物，该菌株产耐热葡萄糖氧化酶与一般普通微生物产酶相比具有许多明显的优势，如较高温度下发酵培养一般不容易感染杂菌；该菌株产耐热葡萄糖氧化酶具有较高的温度稳定性和较高的反应温度，而较高的反应温度能够提高酶的反应速率和水解效率。另外，热稳定的酶更有利于运输、储藏和使用，更适合于工业化应用等。目前国内外关于嗜热拟青霉产葡萄糖氧化酶还未见报道。因此，嗜热拟青霉开发耐热性的葡萄糖氧化酶就有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术不足提供一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉及其筛选方法，该筛选方法操作简单、快速，该菌株具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到性质稳定的葡萄糖氧化酶，该复合酶耐高温、耐酸性好，特别适合用做饲料酶。本专利技术所提供的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株(Paecilomycesthermophila)，其于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13182。本专利技术还提供了上述高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，先将嗜热拟青霉出发菌株通过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变得到突变菌株，再将突变菌株筛选后，进行硫酸二乙酯和微波复合诱变和第二次筛选得到嗜热拟青霉诱变菌株。作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法具体包括以下步骤：(1)采样及样品处理：采用多点混合土样采集方法，从正处于高温发酵的堆肥中取土样，取样深度为15-20cm，土样为由若干样点组成的混合样品，每个点的取土深度及质量均匀一致，混合样品取500g，采样季节为夏季，称取混合样品内固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入50-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液；(2)菌株初筛：将以上处理后的土样浑浊液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的浑浊液各0.1-0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，待该培养基培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于30-40℃恒温培养箱中倒置培养18-72h，然后将平板置于30-45℃恒温培养箱中继续倒置培养1-3d，将平板上长出的菌落点种到葡萄糖氧化酶初筛培养基上，接种好的培养皿30-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d，然后置于4℃冰箱中静置1-2d，接着在室温下存放1-2d，挑取透明圈较大的菌株接种至斜面培养基，进一步复筛；(3)菌株纯化：将步骤(2)初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于30-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化；(4)菌株复筛：将初筛得到的纯化后各菌株分别接种到固体种子培养基上，30-40℃下培养3-5d，待孢子充分成熟后，加入无菌水，将孢子充分洗下，无菌水稀释孢子液至浓度为104-6个/ml，取孢子稀释液5-10ml接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下30-40℃进行液体震荡培养，培养2-3d后，按照6-10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下30-45℃进行液体震荡发酵培养，发酵培养3-7d，取发酵液12000r/min，10min离心后收集上清液测定葡萄糖氧化酶酶活性，选取酶活性较高的菌株进行划线传代培养，直至得到一株产酶稳定且有较高酶活的耐高温葡萄糖氧化酶产生菌株，即为嗜热拟青霉出发菌株；其中，霉菌筛选培养基成分为：PDA培养基800mL，孟加拉红0.01-0.025g，氯霉素0.1-0.15g，无机盐营养液0.5-1mL，补水至1000mL，琼脂粉15g，该培养基中孟加拉红和氯霉素灭菌后加入，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min；葡萄糖氧化酶初筛培养基由底层培养基和上层培养基构成，底层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO40.388g/L、KH2PO40.188g/L、MgSO4·7H2O0.156g/L、CaCO33.5g/L、琼脂15g/L；上层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、可溶性淀粉10g/L、KI1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，并控制pH为4.0-5.0。作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述固体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL、无机盐营养液1mL、琼脂粉1.5g，并控制pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体发酵培养基的成分如下：PDA培养基80mL、无机盐营养液1mL、蛋白胨1g、吐温800.5mL、(NH4)2SO41g，pH为4.0-5.0，补充去离子水至100mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。作为对上述诱变方法的进一步说明，所述无机盐营养液为：NaNO32.0g，K2PO41.5g，CaCl21.5g，MgSO40.3g，FeSO4·7H2O0.1g，MnSO4·H2O1.6mg，ZnSO4·H2O0.05g，CoCl20.5mg，(NH4)2SO45g，去离子水1000mL。作为对上述诱变方法的进一步说明，其具体步骤为：(1)将嗜热拟青霉出发菌株接到固态营养活化培养基斜面上，于28-34℃培养3-4天；从活化的斜面上刮取孢子接种到摇瓶培养基，于28-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株Paecilomyces thermophila，其于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。

【技术特征摘要】
1.一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株Paecilomycesthermophila，其于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13182。2.如权利要求1所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，先将嗜热拟青霉出发菌株通过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变得到突变菌株，再将突变菌株筛选后，进行硫酸二乙酯和微波复合诱变和第二次筛选得到嗜热拟青霉诱变菌株。3.根据权利要求2所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法具体包括以下步骤：(1)采样及样品处理：采用多点混合土样采集方法，从正处于高温发酵的堆肥中取土样，取样深度为15-20cm，土样为由若干样点组成的混合样品，每个点的取土深度及质量均匀一致，混合样品取500g，采样季节为夏季，称取混合样品内固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入50-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液；(2)菌株初筛：将富集后的培养液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的培养液各0.1-0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，待该培养基培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于30-40℃恒温培养箱中倒置培养18-72h，然后将平板置于30-45℃恒温培养箱中继续倒置培养1-3d，将平板上长出的菌落点种到葡萄糖氧化酶初筛选择培养基上，接种好的培养皿30-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d，然后置于4℃冰箱中静置1-2d，接着在室温下存放1-2d，挑取透明圈较大的菌株接种至斜面培养基，进一步复筛；(3)菌株纯化：将步骤(2)初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于30-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化；(4)菌株复筛：将初筛得到的纯化后各菌株分别接种到固体种子培养基上，30-40℃下培养3-5d，待孢子充分成熟后，加入无菌水，将孢子充分洗下，无菌水稀释孢子液至浓度为104-6个/ml，取孢子稀释液5-10ml接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下30-40℃进行液体震荡培养，培养2-3d后，按照6-10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下30-45℃进行液体震荡发酵培养，发酵培养3-7d，取发酵液12000r/min，10min离心后收集上清液测定葡萄糖氧化酶酶活性，选取酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，直至得到一株产酶稳定且有较高酶活的耐高温葡萄糖氧化酶产生菌株，即为嗜热拟青霉出发菌株；其中，霉菌筛选培养基成分为：PDA培养基800mL，孟加拉红0.01-0.025g，氯霉素0.1-0.15g，无机盐营养液0.5-1mL，调节pH4.0-5.0，补水至1000mL，琼脂粉15g，该培养基中孟加拉红和氯霉素灭菌后加入，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min；葡萄糖氧化酶初筛培养基由底层培养基和上层培养基构成，底层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO40.388g/L、KH2PO40.188g/L、MgSO4·7H2O0.156g/L、CaCO33.5g/L、琼脂15g/L；上层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、可溶性淀粉10g/L、KI1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，并控制pH为4.0-5.0。4.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述固体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL、无机盐营养液1mL、琼脂粉1.5g，并控制pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。5.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。6.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体发酵培养基的成分如下：PDA培养基80mL、无机盐营养液1mL、蛋白胨1g、吐温800.5mL、(NH4)2SO41g，pH为4.0-5.0，补充去离子水至100mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。7.根据权利要求3-6任一项所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述无机盐营养液为：NaNO32.0g，K2PO41.5g，CaCl21.5g，MgSO40.3g，FeSO4·7H2O0.1g，MnSO4·H2O1.6mg，ZnSO4·H2O0.05g，CoCl20.5mg，(NH4)2SO45g，去离子水1000mL。8.根据权利要求2或3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青...

【专利技术属性】
技术研发人员：高兆建，张铁柱，李同祥，刘恩岐，曹建冬，顾强，沈彬彬，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32