米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用，所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液和等体积蒸馏水的混合液为生物催化剂，以槐角苷为底物，构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；本发明专利技术在底物投料浓度为1g/L时，染料木素的转化得率为84.2％，纯度为92.5％。本发明专利技术把低活性的槐角苷转化活性更好的染料木素，是一种可选的生产染料木素生产方法，工艺具有生产成本低、转化率高、环境污染小等优点。

LJH3 and Rhizopus oryzae in the biotransformation of Sophoricoside in preparation and application of Genistein

The invention discloses a preparation and application of Rhizopus oryzae LJH3 of genistein in transformation of Sophoricoside in biological system, the application is the fermentation broth of Rhizopus oryzae LJH3 after fermentation the fermentation liquid was removed by filtration or filtrate and distilled water mixture as a biological catalyst, to Sophoricoside as substrate, a transformation system, from 30 to 38 DEG C, 200 ~ 250r/min under the condition of constant temperature oscillation conversion reaction, reaction after transforming liquid separation and purification, to obtain genistein; the substrate feed concentration is 1g/L, genistein conversion rate was 84.2%, the purity was 92.5%. The low activity of genistein Sophoricoside transforming activity better, is the production of genistein, a production method of optional, technology has the advantages of low production cost, high conversion rate, little environmental pollution and so on.

【技术实现步骤摘要】
米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用(一)
本专利技术涉及一种以槐角苷为原料生物转化制备染料木素的方法。(二)
技术介绍
染料木素(genistein)又称染料木黄酮、染料木因和金雀异黄素等，化学名5,7,4′-三羟基异黄酮(CAS号为446-72-0，分子式为C15H10O55，分子量为270.24)，属于异黄酮类化合物。染料木素具有雌激素样作用，并具有抗炎、抗生育和预防骨质疏松症的疗效，近年来不少学者对染料木素的生物活性进行了研究，发现其还具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤和防治骨质疏松等生物活性。染料木素以游离状态存在于一些豆科植物之中，如槐角、大豆、葛根、山豆根和金雀花等，因此可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低，如槐角中的染料木素含量在0.23～3.2mg/g之间。在上述植物中，染料木素更多的与葡萄糖结合成苷，即槐角苷(sophoricoside，CAS号为152-95-4，分子式为C21H20O10，分子量为432.37)，又名为槐苷、槐黄苷、染料木素-4′-葡萄糖苷(genistein4′-β-D-glucopyranoside)，含量相对较高。如产自河北的槐角中，槐角苷的含量为69mg/g，而染料木素含量仅为3.2mg/g，相差20多倍(高秀叶，尹海龙，陈恒文，等.高效液相色谱法同时测定不同产地槐角中槐角苷和染料木素的含量.现代中药研究与实践，2013(2):73-76)。虽然槐角苷也具有多种生物活性，如清热泻火、凉血止血、清肝明目的功效等药理作用，但是其口服吸收效果较差。有研究报道，槐角苷在体内转化为染料木素后才能发挥效用。可以看出，染料木素具有多重的药理活性，作为药物应用于临床疾病治疗的前景广阔，但缺乏经济有效的生产方法。如果以槐角苷为原料，水解切除葡萄糖残基而转化为染料木素，则是一条可行的生产方法。目前，已有酶法转化的研究报道，如采用β-糖苷酶水解大豆异黄酮的水解工艺，在大豆异黄酮浓度为0.5mmol/L时，染料木素的水解率可达94.2％(张永忠，李木子，孙艳梅，等.“Amano”β-糖苷酶水解大豆异黄酮技术的研究.食品科学，2008,29(5):254-258.)，但该方法使用日本产的商品级β-糖苷酶，成本无疑较高，且底物投料浓度较低，工业化应用存在一定困难；如果采用酸水解法，则存在母核结构容易被破坏，产生较多的副产物，导致产物收率低，分离纯化困难等问题。为了开发一种经济有效的染料木素生产方法，本专利技术采用微生物法转化槐角苷为染料木素(反应式见图1)，筛选获得了一株转化能力高、专一性好的微生物菌株，经培养获得发酵液，以含菌体的发酵液或过滤除去菌体的滤液为生物催化剂，将槐角苷转化为染料木素，在底物浓度为1g/L时，转化得率可达80％以上。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—米根霉(Rhizopusoryzae)LJH3，及其在转化槐角苷制备染料木素中的应用。本工艺具有成本低、流程简单、转化得率高和副产物少等优点。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—米根霉(Rhizopusoryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。本专利技术所述米根霉LJH3，是从中药材槐角的富集培养物，经过筛选得到的优良菌株。所述米根霉LJH3的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2d，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色；假根发达，分枝呈指状或根状，呈褐色；孢囊梗直立或稍弯曲，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色。所述米根霉LJH3的18srDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供一种所述米根霉LJH3在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用，所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液和等体积蒸馏水的混合液为生物催化剂，以槐角苷为底物，构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；所述槐角苷是以溶解于0.1mol/L的NaOH水溶液的形式加入，槐角苷在NaOH水溶液中的浓度为1～100g/L，优选100g/L。进一步，所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为4～5g/L转化体系；所述底物槐角苷的终浓度为0.01～1g/L转化体系(优选1g/L)，其中转化体系的体积以发酵液或发酵液过滤后滤液与等体积蒸馏水混合液的体积计。进一步，所述的转化反应条件为：在30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化20～24h。进一步，所述发酵液按如下方法制备：将米根霉LJH3接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～10g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH5～7。所述的米根霉LJH3菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述米根霉LJH3发酵培养方法为：(1)活化培养：将米根霉LJH3接种于PDA平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得米根霉LJH3孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH5～7。优选的种子培养基组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH6。(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2～5％的接种量接入发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液。所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH5～7。进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，pH7。本专利技术所述的染料木素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取1～3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，加入原转化体系体积1/4～1/5的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。

【技术特征摘要】
1.米根霉(Rhizopusoryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。2.一种权利要求1所述米根霉LJH3在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液与蒸馏水等体积混合液作为生物催化剂，以槐角苷为底物构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；所述槐角苷是以溶解于0.1mol/L的NaOH水溶液的形式加入。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以过滤前发酵液中干菌体重量计为4～5g/L转化体系；所述底物槐角苷的终浓度为0.01～1g/L转化体系。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的转化反应条件为：在30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化20～24h。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：将米根霉LJH3接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～10g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH5～7。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述米根霉LJH3在发酵前，先经平板培养活化制备孢子，或经种子扩大培养制备种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，刘姜华，应国清，易喻，陈建澍，张彦璐，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33