生物材料用透明化试剂、体系及其利用制造技术

本发明专利技术的生物材料用透明化试剂是含有选自尿素及尿素衍生物的至少1种化合物、山梨糖醇、以及浓度为5w/v％以下的表面活性剂的溶液。

Transparent reagents, systems and uses for biological materials

The transparent agent for biological material of the present invention is a solution containing at least 1 compounds selected from urea and urea derivatives, sorbitol, and surfactant with a concentration below 5w/v%.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生物材料用透明化试剂、及其利用。
技术介绍
在使用光学显微镜观察生物材料的深部时，通常会利用透明化试剂来进行处理(透明化处理)。关于透明化试剂及透明化处理方法，具代表性的例如已有专利文献1及非专利文献1中揭示的由Ann-ShynChiang提出的FocusClear(商品名)溶液、或非专利文献2中揭示的由Hans-UlrichDodt等人提出的组织透明法(tissueclearingmethod)。这些技术均用以通过使组织透明化来观察组织中所存在的用荧光物质标记的结构。由于这些方法需要将有机溶剂用作透明化处理的有效成分等，因此存在难以用于生物材料以及会引起作为透明化处理对象的生物材料收缩的问题。鉴于这些问题，本领域开发出了一种使用含尿素的水溶性试剂的透明化技术(Scale)。Scale法建立了对生物材料施以透明化来三维地观察生物材料结构的技术基石。(专利文献2、非专利文献3)。例如，在Scale法公开后，公开了通过含有果糖的溶液来调节折射率，将生物材料透明化的技术(SeeDB)(专利文献3、非专利文献4)。SeeDB法的目的在于将处理过程中发生的生物材料变质抑制在最小程度，光学显微镜观察的结果表明了膜结构、轴突之类的生物材料的形状能得以维持。但是，由于观察对象的折射率变得非常高，因此为了充分发挥观察效果，需要使用双光子显微镜及最适合高折射率的透镜。非专利文献5中，公开了一种使用电泳装置，通过物理化学性方法进行透明化的技术(CLARITY)。CLARITY法中，使用电泳装置对用丙烯酰胺聚合物固定后的脑组织进行物理化学性处理来除去脂质成分，并用两周时间使脑组织透明化。但其存在需要专用设备且工序也复杂的问题。另外，电泳会随着时间而发热，因此难以防止生物材料中的蛋白质的热变质。此外，由于CLARITY法利用高浓度(4％)的离子性表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)使脂质从组织溶出，由此消除脂质膜导致的光散射来进行透明化，因此会对细胞的原生质膜、分泌小泡等结构、以及脂质膜中浮游的蛋白等造成大幅损伤。像这样，虽然继使用尿素的透明化技术Scale法之后开发了多种多样的生物材料透明化技术，但显然只有Scale具有优点。Scale法中，例如不存在SeeDB法中出现的需要使用最适合于高折射率的透镜及双光子显微镜等这些缺乏通用性的装置的问题、以及CLARITY法中出现的专用设备必要性和生物材料热变质的问题。不过，虽然以往的Scale法具有工序非常简便的优点，但也被要求在保持生物材料原形的同时能进一步迅速提高透明度(透光性)。最近，还开发出了一种与Scale技术同样地以利用尿素的透明化为根干，利用进一步含有氨基醇及非离子性表面活性剂的透明化试剂来处理生物材料，从而实现透明度优异的透明化的技术(CUBIC)(非专利文献6)。〔现有技术文献〕专利文献1：美国专利第6472216号公报(授权日2002年10月29日)专利文献2：国际公布WO2011/111876(公开日2011年9月15日)专利文献3：国际公布WO2013/191274(公开日2013年12月27日)非专利文献1：Ann-ShynChiangetal.：InsectNMDAreceptorsmediatejuvenilehormonebiosynthesis.PNAS99(1)，37-42(2002).非专利文献2：Hans-UlrichDodtetal.：Ultramicroscopy：three-dimensionalvisualizationofneuronalnetworksinthewholemousebrain.NatureMethods4(4)，331-336(2007).非专利文献3：Hamaetal.：Scale：achemicalapproachforfluorescenceimagingandreconstructionoftransparentmousebrain.NatNeuroscience14(11)，1481-8(2011).非专利文献4：Keetal.：SeeDB：asimpleandmorphology-preservingopticalclearingagentforneuronalcircuitreconstruction.NatNeuroscience16(8)，1154-61(2013).非专利文献5：Chungetal.：Structuralandmolecularinterrogationofintactbiologicalsystems.Nature497(7449)，332-7(2013).非专利文献6：Susakietal.：Whole-brainimagingwithsingle-cellresolutionusingchemicalcocktailsandcomputationalanalysis.Cell157(3)，726-39(2014).
技术实现思路
〔专利技术要解决的问题〕迄今为止，在对生物材料进行透明化时，保持生物材料的原形和缩短透明度(透光性)上升时间是互斥的课题，两者未能同时实现。例如，WO2012/147965中公开的技术(ScaleB4)能够缩短生物材料透明度上升的所需时间。但其着重于快速使作为透明化处理有效成分的尿素等进行浸润而用高浓度尿素进行处理，因此会导致生物材料的膨胀(变形)。WO2011/111876中公开的技术(ScaleU2)虽然能有效抑制生物材料的膨胀，但没能获得缩短透明度上升时间的效果。像这样，至今尚未能同时实现生物材料的原形维持和透明度(透光性)上升时间的短缩。CUBIC法缩短了透明度上升时间，但存在因所含的高浓度非离子性表面活性剂的影响而导致细胞组织结构被破坏的忧患。另外，含有氨基醇的CUBIC溶液的pH为11.4，该强碱性会导致构成膜的蛋白质的变质和失活，因此构成细胞中的膜的正常微小结构很可能得不到维持。实际上，本专利技术人使用电子显微镜观察了微小结构，结果发现用CUBIC法处理后的生物材料的细胞中发生了组织形状的严重破坏。根据该见解，本专利技术人注意到CUBIC法中的透明化处理时间的缩短效果其实是因生物材料的变质和细胞微小结构的崩溃而使得透明化试剂变容易浸润的结果。因此，迄今尚无能在保持生物材料原形的基础上不使生物材料中细胞的微小级别的结构发生大幅形状变化、且可以迅速进行透明化的透明化试剂。本专利技术是为了解决所述的课题而完成的，其目的在于，提供一种利用山梨糖醇与作为有效成分的尿素或尿素衍生物的组合所带来的相乘效果的新颖生物材料用透明化试剂、及其利用。〔解决课题的手段〕为了解决所述的课题，本专利技术人进行了专心研究。首先，研究了浸润到生物材料中时可提高透明度的有效成分，结果发现，通过将单独使用时并无实质效果的山梨糖醇与尿素或尿素衍生物组合使用，可发挥出提高透明度的显著效果。另外，山梨糖醇能使生物材料收缩，因此通过将山梨糖醇与尿素组合，获得了可防止ScaleA2、ScaleU2法中出现的生物材料膨胀问题的效果。进一步还发现，当用该透明化试剂对表达了荧光蛋白质的生物材料进行透明化时，与现有的透明化试剂相比，荧光蛋白质的荧光消失少，因此该透明化试剂还适于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物材料用透明化试剂，其是含有选自尿素及尿素衍生物的至少1种化合物、山梨糖醇、以及浓度为5w/v％以下的表面活性剂的溶液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.20 JP 2015-0089281.一种生物材料用透明化试剂，其是含有选自尿素及尿素衍生物的至少1种化合物、山梨糖醇、以及浓度为5w/v％以下的表面活性剂的溶液。2.根据权利要求1所述的生物材料用透明化试剂，其是含有尿素来作为所述化合物的溶液。3.根据权利要求1或2所述的生物材料用透明化试剂，其以15w/v％以上且50w/v％以下的浓度范围含有山梨糖醇。4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物材料用透明化试剂，其以1.0M以上且9.5M以下的浓度范围含有尿素。5.根据权利要求4所述的生物材料用透明化试剂，其中，表面活性剂为非离子性的表面活性剂。6.根据权利要求5所述的生物材料用透明化试剂，其中，所述非离子性的表面活性剂是选自注册商标TritonX、注册商标Tween、及商品名NP-40的至少一方。7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物材料用透明化试剂，其含有甘油。8.根据权利要求1至7中任一项所述的生物材料用透明化试剂，其含有环糊精类。9.根据权利要求1至8中任一项所述的生物材料用透明化试剂，其使来自多细胞动物的组织或器官、或者除人类以外的多细胞动物透明化。10.一种生物材料透明化处理体系，其包含权利要求1至9中任一项所述的生...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫胁敦史，滨裕，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP