一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体是一组特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，以及所述适配体在制备创伤弧菌检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。本发明专利技术以创伤弧菌为靶标，采用以细菌为靶标的‑SELEX技术筛选与创伤弧菌高特异性、高亲和力结合的适配体，稳定性高、可体外合成、易标记功能基团和报告分子，有潜力被开发成为更加灵敏的，检测限更低的生物传感器，与现有的方法相比可以更有效率地完成复杂的临床、食品样本、海水样本中创伤弧菌的检测检验，为食品安全和患者诊疗提供帮助。

A group of highly affinity aptamers with specific binding to Vibrio vulnificus and their use

The invention relates to the technical field of biology, in particular to a group of oligonucleotide aptamers for identifying specific Vibrio vulnificus, and the application of said aptamer in preparing Vibrio vulnificus detection reagent, reagent box or sensor. The present invention to Vibrio vulnificus target by bacteria for ligand binding targets SELEX technology and screening of Vibrio vulnificus high specificity, high affinity, high stability, easy synthesis, in vitro functional groups and molecular marker report, has the potential to be developed into a more sensitive biosensor, lower detection limit, compared to with the existing inspection method can effectively complete the trauma clinical, food samples, water samples in the complex of Vibrio, provide help for food safety and patient care.

【技术实现步骤摘要】
一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，是一组以细菌体为靶标的SELEX(指数富集的配体系统进化技术)技术筛选获得的与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体，可用于临床样本中创伤弧菌的快速检测诊断和水体、食品中创伤弧菌的监测。
技术介绍
创伤弧菌是常见的弧菌属致病菌，革兰阴性短杆菌，亲水嗜盐，有鞭毛。在全世界的沿海区域均有感染病例报道。它是水域中固有菌群的组成部分，在海洋、湖泊以及水生动物体内均可分离得到。创伤弧菌是重要的海洋致病菌，在美国食品药品监督管理局出具的报告中，1992年至2007年间，美国共有459例创伤弧菌感染病例，且致死率高，达到51.7％。创伤弧菌的最佳生长温度是30℃，因此大部分的感染发生在温暖的夏季(北半球的五月至十月)。患者多是通过摄入带菌食物感染，在所有食用海鲜导致的感染死亡病例中，创伤弧菌感染占95％。伤口直接接触带菌的海水也可导致感染，患有慢性肝病的中年男性患者更易被感染。感染症状发生很快，可引起蜂窝组织炎、败血症、肠胃道症状等。摄入或接触后最快4小时即可发病，有感染24小时内死亡的病例。如果在3天内没有得到妥善治疗，患者的死亡率可达到100％。因此，对水域内和食品中的创伤弧菌进行监控对于食品安全、环境安全是有重要意义的，临床上对创伤弧菌进行快速诊断更是对患者的诊疗有着重要的意义。目前，我国现行的鉴别诊断临床样本和食品样本中创伤弧菌的方法需要先增菌，后鉴定。首先使用碱性蛋白胨水或效果更好的蛋白胨-NaCl-纤维二糖(PNC)肉汤进行增菌，继而转种固体选择性培养基，如TCBS培养基，再通过生化试验对可疑菌落进行鉴别检验。然而，有研究发现，TCBS培养基筛选得到的阳性菌落中仅有51％是弧菌属细菌，准确率较低。全自动分析仪也可检测创伤弧菌，如生物梅里埃公司出产的全自动细菌鉴定及药敏分析系统和布鲁克·道尔顿公司出产的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。这些方法也需要初步的微生物鉴定结果，通常需要3-4天才能得到最终鉴定到种的结果，费时较久。在临床上使用这些手段，难以给予患者及时的，针对性的治疗方案。不但如此，基于培养的方法无法诊断出活的非可培养条件(VBNC)下的创伤弧菌，而VBNC状态下的创伤弧菌依然具有致病性。尽管通过PCR的手段，可以针对性扩增创伤弧菌特异性基因vvhA，16SrRNA等基因，对108以上的VBNC细菌进行检测，但是在自然界中，VBNC状态下的细菌很难达到这样高的数量，有研究发现100个细菌即可引发感染。因此，需要有一种快速、敏感的检测方法可以直接与创伤弧菌结合，指示它的存在。近些年来，研究者们开始探索可以用于检测细菌的，与细菌直接结合的分子。单链的核苷酸链单链构象多态性，可以折叠成构象特殊且稳定的结构，是检测细菌的理想选择。适配体是可以特异性与靶物质结合的单链核苷酸，可以是ssDNA或ssRNA，结合的靶物质可以是金属离子，小分子，毒素，药物蛋白甚至是整个细胞。适配体是核酸分子，没有毒性和免疫源性，非常适合于开发成为检测检验工具和靶向治疗的元件。核酸单链可以批量地合成，可以按照需求在3’端或5’端添加荧光基团和其他的功能基团，而且可以很方便地固化在许多基质上，这些特性都使得它适合于定量检测。与抗体相比较，适配体的分子更小，更稳定，可以在更大的温度范围中保持特性。此外，适配体可以在体外快速地、批量地低成本合成，无批间差异，也不涉及动物源性材料，既避免了传染源和免疫活性，也维护了动物福利。但是关于一种与创伤弧菌具有高特异性、高亲和力结合的适配体目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能够与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体。本专利技术的第二目的在于提供通过截短的方法对该适配体进行优化，得到的TV8和TV13同样能够特异性结合创伤弧菌的适配体。本专利技术的再一目的是提供上述适配体在临床分离菌株的鉴定中、在食品安全的监控中、在海水浴场水质的监控中等多方面的应用。本专利技术的主要技术方案是：利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以完整的创伤弧菌活菌菌体为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配体V8、V13。经鉴定，V8和V13的随机区域具有同样的性质。可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体修饰成为报告适配体，用于临床血液样品、食品、水体中创伤弧菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。本专利技术的第一方面，提供一组特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，具有如下所示的通式：5’-AGTATACGTATTACCTGCAGC-N25-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3’；其中N代表脱氧核糖核酸碱基中A，T，C，G中任一个，N25代表长度为25个碱基的随机序列。优选的，所述的寡核苷酸适配体其长度为66个碱基，随机区长度为25个碱基，对引物区进行添加、去除、修饰对其功能没有任何影响。优选的，所述的寡核苷酸适配体其5’端或3’端可以标记FITC、生物素等，修饰后的适配体可与其他传感器联用对创伤弧菌进行分析检测。优选的，所述的寡核苷酸适配体为单链DNA适配体，选自以下序列中的任一条：V8:如SEQIDNO：1所示；V9：如SEQIDNO：2所示；V11：如SEQIDNO：3所示；V12：如SEQIDNO：4所示；V13：如SEQIDNO：5所示；V18：如SEQIDNO：6所示；V20：如SEQIDNO：7所示；V28：如SEQIDNO：8所示；V31：如SEQIDNO：9所示；V38：如SEQIDNO：10所示；V39：如SEQIDNO：11所示；V40：如SEQIDNO：12所示；V41：如SEQIDNO：13所示；V44：如SEQIDNO：14所示；V49：如SEQIDNO：15所示；V53：如SEQIDNO：16所示；V59：如SEQIDNO：17所示；V69：如SEQIDNO：18所示。本专利技术的第二方面，提供以上述单链DNA适配体为基础，通过截短的方法进行优化得到序列更短，成本更低的特异性结合创伤弧菌的适配体，命名为TV8，如SEQIDNO：19所示；TV13，如SEQIDNO：20所示。所述的TV8，TV13适配体，在其5’端或3’端可以进行生物素、荧光分子、同位素、电化学、酶或巯基等化学修饰。本专利技术的第三方面，提供上述寡核苷酸适配体在制备创伤弧菌检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。所述的试剂、试剂盒或传感器可用于检测食品、水体、临床样本中的创伤弧菌。本专利技术还提供了上述寡核苷酸适配体与流式细胞技术联用的应用。联用后的生物传感器空白限是7CFU/mL，理论检测限是29.7CFU/mL，可靠的检测限为100CFU/mL，线性范围是500-500,000CFU/mL，检测时间<1h。本专利技术以创伤弧菌为靶标，采用以细菌为靶标的-SELEX技术筛选与创伤弧菌高特异性、高亲和力结合的适配体，稳定性高、可体外合成、易标记功能基团和报告分子，有潜力被开发成为更加灵敏的，检测限更低的生物传感器，与现有的方法相比可以更有效率地完成复杂的临床、食品样本、海水样本中创伤弧菌的检测检验，为食品安全和患者诊疗提供帮助。因此，本专利技术的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。本专利技术优点在于：1、与抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，具有如下所示的通式：5’‑AGTATACGTATTACCTGCAGC‑N25‑GCAAGATCTCCGAGATATCG‑3’；其中N代表脱氧核糖核酸碱基中A，T，C，G中任一个，N25代表长度为25个碱基的随机序列。

【技术特征摘要】
1.一组特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，具有如下所示的通式：5’-AGTATACGTATTACCTGCAGC-N25-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3’；其中N代表脱氧核糖核酸碱基中A，T，C，G中任一个，N25代表长度为25个碱基的随机序列。2.根据权利要求1所述的特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，其特征在于，所述的寡核苷酸适配体在其5’端或3’端进行FITC或生物素修饰。3.根据权利要求1所述的特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，其特征在于，所述的寡核苷酸适配体选自序列SEQIDNO：1-SEQIDNO：18中的任一条。4.特异性识别创伤弧菌的寡核苷酸适配体，其核苷酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘德婧，彭定发，胡波，欧阳生群，周蓉，李振刚，孙铭娟，王梁华，焦炳华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31