The invention belongs to the field of biomedical materials, in particular to a preparation method of bacteriophage hemostatic agent and its application. A phage displaying as hemostatic agent, RGD peptide by phage display, the amino acid sequence of the polypeptide of the formula: Arg Gly Asp other deformation or Arg, Gly, Asp3, amino acids; peptides display in P VIII on the phage coat protein. The invention has the following features: (1): promote blood platelet activation can attract negatively charged platelets and fibrin, increase platelet adhesion and promote thrombosis; (2): rapid hemostasis in the blood fibrin network through the adhesion of RGD phage, can self assemble and form accelerated coagulation network, promote hemostasis the speed and effect, improve the hemostatic mechanism; (3) the use of a wide range: applicable to systemic blood hemostasis, especially provide a new treatment method for treatment of visceral hemorrhage.
【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用
本专利技术属于生物医学材料领域,涉及了一种噬菌体止血剂的制备方法及其应用。
技术介绍
血液凝固通指血液由流动的液状变成不能流动的凝胶状态的过程,主要是凝血因子促使血浆中可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程。正常的血液循环中存在的凝血和抗凝血系统能够相互平衡,从而保证了血液的正常流动。当机体因受到外力打击而出现伤口时,血液中的凝血因子、血小板可以为微小创伤(如轻微割伤)上的伤口迅速止血。重组凝血因子,如凝血因子VII,是一种是传统的人血凝血因子,是全身用止血药的代表,但该凝血因子具有分子量大、生产成本高、价格昂贵、半衰期短(4~6h)、表达量低、不易保存等缺点,大大限制了其在意外事故的急救治疗、手术过程中的创伤、战场上的受伤出血等应用。目前,临床上多采用化学药物如维生素K、酚磺乙胺、氨甲苯酸、重组人白介素-11等来作为止血剂来加速血液的凝固。这些止血药物主要是通过促进凝血因子活性或者抑制纤维蛋白溶解或者促进血小板的凝聚等功能达到凝血的目的。然而,这些药物由于是通过化学合成的凝血剂,存在毒性大,凝血效率低,来源有限等缺点,因此在临床应用当中有限。同时,临时性的止血也需要合适的止血方法来进行快速止血,以防人体组织受到细菌、病毒的感染。随着对止血材料止血性能要求的不断提高,开发出止血速度更快、效果更佳的止血材料势在必行。RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列)或含有RGD序列的蛋白广泛存在于细胞外基质、血浆蛋白以及血管内皮当中,是一种重要的细胞识别位点与信号启动分子,能够与纤维蛋白、激活后的血小板细胞表面特异性相互作用, ...
【技术保护点】
一种噬菌体止血剂,为利用噬菌体展示技术展示RGD多肽,所述多肽的氨基酸序列通式为:Arg‑Gly‑Asp或Arg、Gly、Asp3种氨基酸在内的其他变形;多肽展示在噬菌体的pⅧ外壳蛋白上。
【技术特征摘要】
1.一种噬菌体止血剂,为利用噬菌体展示技术展示RGD多肽,所述多肽的氨基酸序列通式为:Arg-Gly-Asp或Arg、Gly、Asp3种氨基酸在内的其他变形;多肽展示在噬菌体的pⅧ外壳蛋白上。2.权利要求1所述噬菌体止血剂的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:1)噬菌体展示载体的构建,其具体步骤如下:a.设计前引物和后引物用于制备RGD插入片段肽对应碱基序列:Primer1,引入NcoI酶切位点:5′-ATCCATGGCGCGTGGCGACGATCCCGCAAAAGCG-3′;Primer2,引入HindIII酶切位点:5′-GCAAGCTTTTATCAGCTTGCTTTCGAG-3′;b.将Primer1和Primer1分别配成寡聚核苷酸单链溶液,以M13DNA为模板使用pVIIIPhusionDNA聚合酶扩增整个编码序列;c.将表达质粒用限制性内切酶酶切;d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接入载体,得到重组质粒;2)TG1细胞的活化及质粒重组到TG1细胞;a.将TG1细胞接种至LB培养基中,37℃,220r/min培养4h活化;以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌TG1细胞,37℃继续培养,得到感受态细胞;b.挑取单菌落用于扩增细胞,质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性,证明RGD基因序列在TG1细胞表达,得到感受态TG1细胞;3)RGD噬菌体扩增及纯化将步骤2)中的感受态TG1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体,再加入IPTG作为诱导剂,过夜培养;之后高速离心收集上清去除TG1细胞;PEG/NaCl沉...
【专利技术属性】
技术研发人员:毛传斌,帅亚俊,杨明英,
申请(专利权)人:浙江大学,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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