一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF‑α检测试试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF‑α检测试试剂盒及方法，所述检测试剂盒中包括适配体纳米金交联复合物、Buffer和水；所述适配体经SELEX方法筛选得出，适配体的序列如序列表中序列1所示；所述适配体纳米金交联复合物中所用DNA1、DNA2、Linker序列如序列表中序列2、3所示。根据TNF‑α的适配体与其特异性结合的原理，适配体纳米金交联复合物溶液在加入一定量的TNF‑α之后，适配体纳米金交联复合物溶液会由蓝色变为红色，从而用来检测TNF‑α。样品检测：在适配体纳米金交联复合物中滴加含TNF‑α的待测溶液，以水为对照溶液，室温孵育30分钟，通过颜色变化和紫外可见分光光度计进行全波长扫描来观察结果。

Try a kit and method for TNF detection of alpha aptamer cross-linked complexes based on gold nanoparticles

The invention discloses a try kit and method for TNF detection alpha gold nanoparticle aptamer cross-linked complexes based on the detection kit including gold nanoparticle aptamer cross-linked complexes, Buffer and water; the aptamer obtained by SELEX screening, aptamer sequences such as sequence 1 in the sequence list shown in the right place; DNA1, DNA2, Linker sequence of sequence in a sequence table 2 and 3 shows gold nanoparticles cross-linked complexes of ligands. According to the principle of TNF alpha and aptamers specific binding aptamer, gold nanoparticles cross-linked complex solution after adding a certain amount of TNF alpha, gold nanoparticle aptamer cross-linked complex solution will be changed from blue to red, which is used to detect TNF alpha. Sample: in the detection of gold nanoparticle aptamer cross-linked composite drop test solution containing TNF alpha, with water as the control solution, incubated at room temperature for 30 minutes, the color change and UV VIS spectrophotometer for full wavelength scanning to observe the results.

【技术实现步骤摘要】
一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试试剂盒及方法
本专利技术属于检测试纸
，涉及一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试试剂盒及方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一种危害性高、医疗护理成本巨大、尚无根治方法的神经退行性疾病。随着我国社会老龄化过程，患者人数逐年增加，给社会带来了极大的负担，因此AD的早期诊断和干预具有重大意义。已有的AD临床检测手段主要为：依靠认知量表测试结合核磁共振扫描，鉴定结果可靠度高，但对AD早期诊治敏感性不佳(患者没有明显症状或具有轻微的认知功能的减退(mildcognitiveimpairment，MCI))；此外，检测样本为脑脊液，取样时常采用脊椎穿刺等手段，有副作用，并且不能进行多次取样，给疾病的追踪性检测带来困难。体液标志物作为一种敏感性佳、特异性高、易于使用的指示剂，可真实反应AD的病理进程。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的炎症因子，参与机体的炎症反应。脑内慢性炎症反应是AD的重要病理特征之一。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试试剂盒及方法，利用核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测TNF-α，能够简便、快速的检测待测样品中是否含有TNF-α。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试剂盒，包括：纳米金溶液，其中包括用于形成纳米金交联复合物的纳米金颗粒；巯基化的单链序列DNA1和DNA2，DNA1、DNA2分别与纳米金颗粒连接，形成AuNPs-DNA1颗粒和AuNPs-DNA2颗粒；单链连接序列Linker，Linker含有与TNF-α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；DNA1、DNA2和Linker可杂交形成双链；在进行检测时，AuNPs-DNA1颗粒、AuNPs-DNA2颗粒和Linker在缓冲液中孵育后杂交形成纳米金交联复合物。所述的纳米金交联复合物在与TNF-α结合前为团聚状态，反应溶液为蓝色；纳米金交联复合物与TNF-α结合后，TNF-α与Linker上的适配体序列结合，破坏适配体纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，反应溶液由蓝色变为红色。所述的DNA1的核苷酸序列为：TCACTTCGCTGAAAAAAA-(CH3)3-SH；所述的DNA2的核苷酸序列为：SH-(CH3)6-CTGTATTGTCGC；所述的Linker的核苷酸序列为：TCCTCCATCCGCGAGTGGGCGACAATACTGTCAGCGTTCACT。一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测方法，包括以下操作：1)纳米金的制备：利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒2)巯基化的DNA1、DNA2分别与纳米金经盐老化方法连接形成AuNPs-DNA1颗粒和AuNPs-DNA2颗粒；3)将AuNPs-DNA1颗粒、AuNPs-DNA2颗粒和Linker杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；4)将得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清；沉淀重悬后得到重悬液；5)向得到的重悬液中加入待检液，用加等量水作对照，孵育；6)观察待检液加入后重悬液的颜色变化，若待检液中含有TNF-α，TNF-α特异性结合Linker上的适配体，破坏纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，重悬液由蓝色变为红色；同时用紫外可见分光光度计测定其全波长。所述纳米金的制备为：将氯金酸边搅拌边加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，溶液由蓝转为红色后持续加热2～8min，冷却后得到纳米金溶液。所述DNA1、DNA2在与纳米金结合前，先将其溶于灭菌超纯水中；DNA1、DNA2的浓度为0.1-1mM。所述的Linker的浓度为10-100μM；杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜。所述的DNA1、DNA2和Linker的比例为1～10：1～10：1～10；所述的重悬液含有100-300mMNaCl和30mMTris-acetate；重悬液的pH为7～8；所述的待检液中TNF-α为溶解状态。所述的孵育条件为室温孵育1h；全波长扫描时的波长为400-900nm。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术提供的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试纸条及方法，利用基于核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测TNF-α，基于靶标特异性，优选出核酸适配体，核酸适配体无需标记，无需使用大型的仪器设备，克服了适配体需要标记而导致成本提高和电化学操作相对复杂的不足，降低了检测成本。本专利技术提供的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试纸条及方法，选择性和特异性好，这是由核酸适配体本身的特点和结构决定的，在筛选适配体的过程中加入TNF-α，用SELEX筛选方法，选出能与TNF-α特异性结合而不与其他物质发生特异性反应的核酸适配体；本专利技术提供的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试剂盒，基于AD进程中伴随的脑内神经炎症反应的发生，AD早期患者血清中TNF-α水平显著升高，可用于AD早期检测或其他炎症相关疾病的快速诊断，具有简便、快速、可靠性高等优点。附图说明图1为NUPACK模拟分析DNA1、DNA2和Linker交联分析图；通过模拟分析，这三条单链杂交形成双链时所释放出的自由能为-52.11kcal/mol，可以看出这三条单链可以形成稳定的双链结构；图2为本专利技术的检测原理示意图，小球为分散状态的纳米金颗粒，为DNA1、DNA2、巯基连接的AuNPs-DNA1和AuNPs-DNA2通过Linker可以杂交形成网状结构的复合物，溶液由红色变为蓝色；引入TNF-α后，蓝色复合物的网状结构破坏，复合物分离成为AuNPs-DNA1和AuNPs-DNA2，纳米金呈现分散状态，溶液显示红色。图3为适配体纳米金交联复合物交联前后的对比图，单分散状态的纳米金粒径在10～20nm左右，溶液呈现红色，当其通过适配体和纳米金表面的DNA1、DNA2交联后，溶液颗粒变大，呈现蓝紫色。图4为适配体纳米金交联复合物交联前后的全波长扫描图，分散状态的纳米金最大吸收峰在520nm左右，当纳米金团聚后，溶液会发生红移现象。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术提供的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试纸条及方法，利用核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测TNF-α，基于核酸适配体和纳米金交联复合物来进行的，下面分别对其进行说明。关于核酸适配体：适配体是在体外通过SELEX过程人工筛选出来的一类和靶分子有着高度的特异性亲和能力的短链寡核苷酸序列，就像抗原-抗体结合一样，靶分子可以和它对应的适配体特异性地结合。SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)，利用分子生物学的技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，将寡核苷酸文库和靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF‑α检测试剂盒，其特征在于，包括：纳米金溶液，其中含有用于形成纳米金交联复合物的纳米金颗粒；巯基化的单链序列DNA1和DNA2，DNA1、DNA2分别与纳米金颗粒连接，形成AuNPs‑DNA1颗粒和AuNPs‑DNA2颗粒；单链连接序列Linker，Linker含有与TNF‑α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；DNA1、DNA2和Linker可杂交形成双链；混合后，AuNPs‑DNA1颗粒、AuNPs‑DNA2颗粒和Linker在缓冲液中孵育后杂交形成纳米金交联复合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试剂盒，其特征在于，包括：纳米金溶液，其中含有用于形成纳米金交联复合物的纳米金颗粒；巯基化的单链序列DNA1和DNA2，DNA1、DNA2分别与纳米金颗粒连接，形成AuNPs-DNA1颗粒和AuNPs-DNA2颗粒；单链连接序列Linker，Linker含有与TNF-α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；DNA1、DNA2和Linker可杂交形成双链；混合后，AuNPs-DNA1颗粒、AuNPs-DNA2颗粒和Linker在缓冲液中孵育后杂交形成纳米金交联复合物。2.如权利要求1所述的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试剂盒，其特征在于，所述的纳米金交联复合物在与TNF-α结合前为团聚状态，反应溶液为蓝色；纳米金交联复合物与TNF-α结合后，TNF-α与Linker上的适配体序列结合，破坏适配体纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，反应溶液由蓝色变为红色。3.如权利要求1所述的基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA1的核苷酸序列为：TCACTTCGCTGAAAAAAA-(CH3)3-SH；所述的DNA2的核苷酸序列为：SH-(CH3)6-CTGTATTGTCGC；所述的Linker的核苷酸序列为：TCCTCCATCCGCGAGTGGGCGACAATACTGTCAGCGTTCACT。4.一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF-α检测方法，其特征在于，包括以下操作：1)纳米金的制备：利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒；2)巯基化的DNA1、DNA2分别与纳米金经盐老化方法连接形成AuNPs-DNA1颗粒和AuNPs-DNA2颗粒；3)将AuNPs-DNA1颗粒、AuNPs-DNA2颗粒和Linker在缓冲溶液中杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；其中，Linker含有与TNF-α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；4)将得到的适配体...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔宇，孔令洪，杨桂芳，樊璠，祁红斌，刘健康，龙建纲，
申请(专利权)人：西安交通大学，苏州颐生方生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61