一种反应型巯基化合物探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种反应型巯基化合物探针及其制备方法，基于硫醇参与的二硫键断裂反应，传感分子释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度显著性增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对巯基化合物的特异性识别响应，检测限达0.124 μM。

Reactive sulfhydryl compound probe and preparation method thereof

The invention discloses a reactive thiol probe and its preparation method, reaction of two disulfide bond in thiol based sensing molecules release Luo Danming dye monomer, the fluorescence intensity increased significantly with obvious color change, the interference from almost no influence on the detection results, thus realizing the specific identification of sulfhydryl compounds in response to the detection limit of 0.124 M.

【技术实现步骤摘要】
一种反应型巯基化合物探针及其制备方法
本专利技术属于有机合成
，具体涉及一种反应型巯基化合物探针及其制备方法。
技术介绍
生物体内许多蛋白质和小分子中都含有巯基，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)。巯基在生物体内细胞的抗氧化系统中具有极其重要的作用，它可以防止生物体内细胞受到氧化伤害。医学研究表明谷胱甘肽及半胱氨酸与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症等，它们在生物体内的含量变化可以作为这些疾病诊断的依据，因此开发选择性地检测半胱氨酸的检测方法尤其重要。目前测定氨基酸含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循环法、毛细管电泳法和HPLC法等，这些方法各有优点，但也都有不足之处。比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差；碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法，但对样品溶液的酸度和温度反应敏感，不易操作；酶循环法是利用酶的底物特异性来放大被测物质的测定方法，但使用的工具酶用量大，成本较高；毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低，而且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性；HPLC法准确性高，样品处理简单，但受色谱柱局限，且耗费时间很长。在这些检测方法中，荧光探针法因其探针特殊的光物理特性和光化学特性，不仅可以有效地提高检测的灵敏度，而且具有动态响应范围广的特点，更重要的是可以检测活体甚至单个活细胞中的巯基含量，从而成为了目前广泛应用的检测生物体内巯基的一种重要的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种反应型巯基化合物探针，还提供了该反应型巯基化合物探针的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种反应型巯基化合物探针，探针分子式为C39H25NO5S2，结构式如下：上述反应型巯基化合物探针的制备方法，包括以下步骤：(1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：(2)化合物1与苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：(3)化合物2与化合物3反应得到目标产物反应型巯基化合物探针，化合物3的化学式如下：优选地，步骤(2)中苊酚的制备方法包括以下步骤：1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6，冰水混合物的体积为反应液体积的10～20倍；2)将步骤1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；其中，柱色谱分离时洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝38～42：1；3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；4)将步骤3)所得苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得苊酚纯品；其中，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝28～32：1。优选地，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，甲苯中间苯二酚的投加量为2～3mol/L，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。进一步，步骤(2)中化合物2的制备方法具体为：向甲苯中加入化合物1、苊酚及甲磺酸，于60～70℃搅拌25～35分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，真空干燥，得到化合物2纯品；其中，甲苯中化合物1的投加量为0.09～1.0mol/L，化合物1、苊酚及甲磺酸的摩尔比为1：1：26～27，柱色谱洗脱时洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝48～52：1。优选地，步骤(3)中化合物3的制备方法包括以下步骤：1)向苯并噻吩-2-硼酸的乙醇溶液中加入过氧化氢，搅拌反应6～10小时后，蒸出乙醇后的产物溶于水中，并与用氯仿萃取，干燥氯仿萃取相，并在真空浓缩，进一步采用硅胶分离提纯，得到中间体3-1；其中，苯并噻吩-2-硼酸与过氧化氢的摩尔比为1：3～3.5，硅胶分离提纯时洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯＝9：1；2)将步骤1)中所得中间体3-1溶于四氢呋喃中，升温至55～65℃，加入单水氢氧化锂的水溶液，搅拌15～18小时后，冷却至室温，加入水和乙醚的混合溶液至反应停止，再加入浓盐酸调节pH值为1.8～2.2，分离有机层，经洗涤、干燥、蒸除有机溶剂后，用层析柱分离纯化，得到中间体3-2；其中，中间体3-1与单水氢氧化锂的摩尔比为1：1.2～2，层析柱分离纯化时洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯＝9：1。3)将步骤2)所得中间体3-2加入至2,2’-二硫二吡啶的二氯甲烷溶液中，于±1℃反应8～15分钟后，再升至室温反应5～8小时，蒸除有机溶剂，采用硅胶分离提纯，即得化合物3；其中，中间体3-2与2,2’-二硫二吡啶的质量比为1：1.2～1.4，硅胶分离提纯时洗脱剂采用石油醚：丙酮＝3：1。优选地，步骤(3)中反应型巯基化合物探针的制备方法具体为：向二氯甲烷中加入化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶，于±2℃搅拌8～15分钟，得到反应液；将N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液加入反应液中，升至室温并搅拌20～30小时，经柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝4.5～5.5：1，真空干燥，即得；其中，二氯甲烷中化合物2的投加量为0.025～0.027mol/L，化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1.0～1.1：0.75～0.80，所述N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液中N,N'-二环己基碳酰亚胺的浓度为0.65～0.67mol/L。上述苊酚的合成路线如下：上述化合物3的合成路线如下：上述反应型巯基化合物探针的合成路线如下：上述反应型巯基化合物探针在巯基化合物荧光检测中的应用。本专利技术中所使用的各种原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法获得。本专利技术基于硫醇参与的二硫键断裂反应，传感分子释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度显著性增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对巯基化合物(尤其是谷胱甘肽及半胱氨酸)的特异性识别响应，检测限达0.124μM。附图说明图1是反应型巯基化合物探针(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反应型巯基化合物探针，其特征在于，探针分子式为C39H25NO5S2，结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种反应型巯基化合物探针，其特征在于，探针分子式为C39H25NO5S2，结构式如下：2.权利要求1所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：(2)化合物1与苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：(3)化合物2与化合物3反应得到目标产物反应型巯基化合物探针，化合物3的化学式如下：3.根据权利要求2反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中苊酚的制备方法包括以下步骤：1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6；2)将步骤1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；4)将步骤3)所得苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得苊酚纯品。4.根据权利要求2所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。5.根据权利要求4所述反应型巯基化合物探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许志红，侯旭锋，李博伦，李振升，谢文，
申请(专利权)人：许昌学院，
类型：发明
国别省市：河南,41