一种鸭2型腺病毒灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鸭2型腺病毒灭活疫苗，其中抗原为灭活后的GD株病毒；GD株病毒于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633。本发明专利技术制备的鸭2型腺病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明专利技术中制备的灭活疫苗对鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Duck type 2 adenovirus inactivated vaccine

The invention provides a duck adenovirus type 2 inactivated vaccine, inactivated GD virus antigen which is alive after; GD virus culture collection center at the Wuhan University in June 5, 2016 Chinese typical preservation, the preservation number is CCTCC No:V201633. The duck type 2 adenovirus inactivated vaccine prepared by the invention has good safety and no local or systemic adverse effects caused by the vaccine. The preservation period test after analysis of characteristics, safety test, validity test data, the indicators are stable and effective; using serological methods and immune immune effect, evaluation results show that virus vaccine, the invention in the preparation of inactivated vaccine provides effective immune protection of the ducks, with good commodity development prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭2型腺病毒灭活疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸭2型腺病毒灭活疫苗。技术背景腺病毒是家禽常见的传染性病原体。禽腺病毒分为三个群：Ⅰ群是从鸡、火鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离出来的禽腺病毒，有共同的群特异性抗原，可分为A、B、C、D、E5个种和12个血清型；Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒、雉大理石皮病病毒和鸡大脾病病毒；Ⅲ群是从鸡产蛋综合征和鸭分离到的腺病毒。鸭2型腺病毒属于Ⅰ群禽腺病毒，是1977年法国匈牙利人从患病番鸭上分离出来的，感染鸭主要表现精神沉郁，下痢，消瘦等症状。病毒一旦带入鸭群很难清除，主要有传播方式决定的，即水平传播和垂直传播，给饲养业造成严重的经济损失。通过对Ⅰ群鸭2型腺病毒的流行病学调查，发现该病在我国鸭群中发病率日益上升趋势。基于目前，国内外没有预防该病的商品化灭活疫苗，该病还在不断蔓延。研制安全有效的灭活疫苗迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸭2型腺病毒灭活疫苗，用于预防Ⅰ群鸭2型腺病毒疾病，从而弥补现有技术的不足。本专利技术提供一种鸭2型腺病毒灭活疫苗，其中抗原为灭活后的GD株病毒；所使用的鸭2型腺病毒GD株，于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：V201633。所述的疫苗为灭活疫苗。上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；本专利技术的灭活疫苗的制备方法是将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1:2混合乳化，得到鸭2型腺病毒灭活疫苗。本专利技术制备的鸭2型腺病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本专利技术中制备的灭活疫苗对鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。附图说明图1：筛选病毒的接种图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1GD株的分离与鉴定1、流行病学调查自2014年以来，广东、浙江等地区的部分番鸭出现了一种以死亡率高的Ⅰ群鸭2型腺病毒疾病。对病死的番鸭剖检后，主要的病理变化如下：肝脏肿大、肝坏死，脾脏肿大出血点，胰腺坏死等多器官发生病变为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群鸭2型腺病毒。2015年专利技术人成功从广东某养鸭场的鸭群中分离出一株病毒。2、病毒分离取病鸭的肝脏、脾脏、心包液、胰腺、法氏囊的组织50～100g，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)，按1:5(w/v)比例与无菌生理盐水匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经0.22μm微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将含1％病毒过滤液接种鸭胚成纤维细胞，无血清的M199培养液进行培养，37℃静置培养60～78h，可出现明显的细胞病变，如图1所示，收毒。3、病毒的鉴定3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液，制备成0.8％、1％和2％浓度血红细胞，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群鸭1型腺病毒(EDSV-76)为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群鸭1型腺病毒(EDSV-76)能够凝集鸡、鸭的红细胞。3.2理化特性检验病毒液分别经盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1h)、氯仿、乙醚处理后，接种鸭胚成纤维细胞(0.2ml/T25方瓶)，另设生理盐水处理组作为对照。接种72h后观察细胞病变。结果：分离毒经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在细胞中的增殖，出现明显的细胞病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。而经氢氧化钠(pH10)和温度(50℃、1h)处理后，接种细胞，无细胞病变，PCR检测阴性。表明分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活。3.4PCR检测取病鸭的肝脏、脾脏、心包液、胰腺、法氏囊的组织无菌研磨，反复冻融3次，利用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR反应体系：总体积25ul在0.5m1PCR管中依次加入10×Taq聚合酶缓冲液------------5u12.5mmo14dNTP-------------------4u1上游引物(20pmol)---------------1u1下游引物(20pmol)----------------1u1TaqDNA聚合酶(1-2U)----------0.3ulDNA--------------------------------4ul用灭菌去离子水9.7ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参数：预变性条件为95℃，5min，变性条件为94℃，30Sec，退火温度和时间为53℃，30Sec，延伸温度为72℃延伸35Sec，35个循环，最后72℃延伸10min。经扩增，分离毒株扩增出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。对扩增的片段进行测序、拼接后，通过NCBIBLAST比对分析，分离毒与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，是鸭2型腺病毒序列。与NCBI公布的序列同源性最接近，但也存在序列上的差异。实施例2GD株毒种的制备挑选已长满单层的鸭胚成纤维细胞，弃掉原培养液，加入终浓度1％毒种(GD株原始毒种第3代)无血清的M199维持液，37℃静置培养60～78h，可出现明显的细胞病变，当细胞病变达80％以上时收获。按此方法连传10代，分别标记为C3～C10代。测定每代次病毒含量。将检验无菌且病毒含量≥106.0TCID50病毒液混合，定量分装，冻干保存。实施例3GD株抗原的制备1制苗材料选择鸭胚成纤维细胞、GD株病毒液的制备。2细胞制备取11～13日龄的SPF鸭胚，用0.25％胰酶进行消化，加入适量含10％血清的M199培养液进行培养。3接毒挑选已长满单层的鸭胚成纤维细胞，弃掉原培养液，加入终浓度为1％毒种的维持液，置37℃培养箱继续培养。4收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，收获的细胞毒灭活前在-20℃保存。实施例4GD株病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备1灭活将GD细胞病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。2半成品检验2.1无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。2.2灭活检验将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的鸭胚成纤维细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的鸭胚成纤维细胞作空白对照，37℃、5％CO2培养箱培养，观察168小时。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭2型腺病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原为灭活后的GD株病毒。

【技术特征摘要】
1.一种鸭2型腺病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原为灭活后的GD株病毒。2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的GD株病毒的保藏编号为CCTCCNo：V201633。3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的GD株病毒采用甲醛进...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相芹，王丹娜，刘阳，李晓林，张海波，胡秀香，李焕明，林文超，张玉杰，谭鹏，邵振文，李明义，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37