筛选干扰分子的方法技术

本发明专利技术涉及筛选增强表达基因序列的表达或活性的干扰核酸的方法，所述方法包括将杂合核酸分子引入细胞的步骤，所述杂合核酸分子包括：用于启动翻译的第一非编码序列；与待筛选的所述干扰核酸互补的第二序列，和任选地，编码至少一种预确定肽的第三核苷酸序列，所述第一序列被修饰，使得所述至少一种肽的翻译水平降低至少10％。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】筛选干扰分子的方法
本专利技术涉及一种筛选干扰分子的方法。
技术介绍
已知的RNA干扰(RNAi)现象是基于小核糖核酸分子可以与信使RNA相互作用的事实。由许多酶控制的复杂机制导致信使RNA的降解，从而抑制编码所述信使RNA基因的表达，并且因此抑制由其产生的蛋白质的表达。在小干扰RNA中，已经鉴定了几种RNA，特别是微RNA和发夹RNA，它们能够抑制基因表达，因此通过类似的机制抑制了由此产生的蛋白质。目前，被广泛接受的是为了针对每种受到RNA干扰抑制的感兴趣的基因，来测试每个所考虑的基因的每个干扰RNA。这样的过程是漫长而昂贵的，因为有必要验证所考虑的每个干扰RNA确实发挥其对靶基因表达的抑制作用。此外，有必要验证被认为发挥适当抑制作用的每个干扰RNA，也不会通过也阻止一个或多个基因以外的初始靶向基因的表达而发挥“寄生”抑制作用。专利US8252535描述了与已知干扰RNA序列互补、含有靶向序列的人工序列的用途。而且该方法还可以同时抑制编码不同靶基因的RNA。然而，这种方法仍然不完美，特别是不能有效地筛选特定于天然靶标的干扰RNA。从现有技术也知道对基因表达有积极作用的核酸分子。例如，voutila等人，MolecularTherapy,2012-08-01，描述了用于激活参与细胞全能性基因的siRNA。申请WO2006113246A2描述了激活基因表达的sRNA，特别是通过与启动子区结合。尽管如此，这些分子具有靶向调控序列的作用，但不专门靶向基因的编码序列。因此，本专利技术的目的是克服这些缺点。本专利技术的目的之一是提供一种筛选具有更好灵敏度的干扰分子的方法。本专利技术的另一个目的是涉及一种可以实施筛选干扰分子的方法的杂合核酸，这种方法比现有技术更灵敏。本专利技术的另一个目的是提供能够容易且有效地执行上述方法的装置。因此，本专利技术涉及一种特别是在体外筛选干扰核酸的方法，所述干扰核酸增加：-基因表达和/或-基因和/或从所述基因转录的核糖核酸或RNA的活性，所述干扰核酸与所述基因或所述RNA具有至少部分序列互补性，并且所述方法包括引入杂合核酸分子到真核细胞中步骤，尤其是能够RNA干扰的，杂合核酸分子包括：-用于启动翻译的第一非编码序列，-与被筛选的所述干扰核酸的序列至少部分互补的第二序列，和-编码至少一种确定肽的第三核苷酸序列，所述第三序列处于第一序列的顺式翻译控制下，所述第一序列被修饰，特别是通过取代或缺失或添加至少一个核苷酸，使得所述至少一种肽的翻译水平相对于在所述第一序列的控制下、在其未修改特别是优化形式下的所述至少一种肽的翻译水平降低至少10％。本专利技术基于本专利技术人所作的惊人观察，可以筛选干扰分子，使得当通过具有修饰(非最佳)翻译起始序列的核酸分子选择所述分子时可增加基因表达。因此，本专利技术人首次确定了具有与现有技术中广泛描述和接受的相反性质的干扰RNA，即RNA干扰机制的已知表达抑制性质。在本专利技术中，必须具有包含不是天然的第一翻译起始序列的核酸分子，其不同于使得其可以在野生型真核生物中发现的所述序列(也就是说不具有在所述翻译起始序列的突变)。在本专利技术中，翻译起始序列旨在表示存在于由其引起并且包围起始密码子ATG的基因和信使RNA中的核酸序列。该序列通常称为Kozak序列。在本专利技术中，“最佳”旨在表示特定细胞类型中和在给定培养条件下的确定基因的翻译操作的最大水平。翻译的最佳水平是由所述翻译起始位点控制的RNA产生蛋白质的最大水平，其中由引发剂引入的第一氨基酸的进料转移RNA，甲硫氨酸产生。在天然生理状态下，细胞被认为是不能比其最佳水平给定RNA产生更多的蛋白质。在本专利技术中，“增加基因表达”旨在表示具有获得由所述基因编码的蛋白质量的结果的所有修饰，其高于未经修饰获得的蛋白质的量。因此，在根据本专利技术的干扰核酸的存在下，基因的蛋白质产物(由所述干扰核酸靶向)将比在不存在干扰核酸靶向所述基因情况下的相同基因的蛋白质产物更丰富，或在靶向另一基因的干扰核酸存在下。“增加基因表达”的定义是本领域技术人员使用的常规定义。因此，即使涉及该蛋白质增加的分子机制是转录后的(RNA的稳定化，转录的增加)，仍将提及基因表达中的增加。在本专利技术中，如上所述的“所述基因和/或由所述基因转录的核糖核酸或RNA的活性的增加”对应于导致基因表达增加的机制之一，也就是说由所述基因编码的蛋白质产物的增加。在本专利技术中，干扰分子旨在表示能够通过RNA干扰调节基因表达的核酸分子。因此，本专利技术所涵盖的干扰分子的例子之一是小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。siRNA是含有21至24个核苷酸的小型双链RNA。双链状态的小干扰RNA被称为RISC复合物的蛋白质复合物(用于RNA诱导的沉默复合物)在细胞质中识别。后者通过释放RNA互补链或有义链来活化。该激活的复合物将通过核酸碱基的互补性识别其靶转录物，即信使RNA。这种识别系统确保了这种机制的高度特异性。一旦目标被束缚，作为RISC复合体一部分的阿尔戈(Argonaute)蛋白可以在识别位点切割转录物。因此，Ago可以作为内切核酸酶。由Ago切割的两片转录物将通过其末端被外切核酸酶快速降解。miRNA是能够通过碱基配对形成双链结构的单链RNA。在形成RISC期间，双链miRNA成为单链miRNA。只有作为miRNA靶标的信使RNA的特异性链保留在复合物内。因此，靶mRNA被装载在RISC复合物内。那么两种抑制途径是可能的；如果复合物含有蛋白质Ago2，则靶mRNA的降解，或者如果复合物含有蛋白质Ago1，则抑制该靶mRNA的翻译。shRNAs是采用茎环结构并可能参与RNA干扰现象的RNA。在RISC复合物掺入后，有义链降解。反义链将RISC复合物引导至具有互补序列的那些mRNA。因此，降解的机制类似于siRNA所采用的机制。在本专利技术的上下文中，一些干扰分子能够增加基因表达的机制还没有被阐明。然而，本专利技术人通过本专利技术的方法已经表明，现有技术中通常已知的用于抑制信使RNA的翻译或使信使RNA不稳定的一些分子实际上能够增加所述信使RNA的表达或稳定性。在本专利技术中，“与所述基因或所述RNA具有至少部分序列互补性的所述干扰核酸”是指首先选择要筛选的干扰核酸，以便至少部分地与基因序列互补，或其编码的信使RNA，使得筛选是特异性的。此外，本领域技术人员将理解，干扰核酸不能与它们靶向的基因的序列完全互补，只要它们在核苷酸数目上比目标基因更小。在本专利技术中，杂合核酸分子旨在表示由本质上不相邻的至少两个核酸片段组成的杂合核酸分子。因此，这种杂合分子不是以天然状态存在。如上所述，所述杂合核酸分子包含至少三个序列：-用于启动翻译的第一非编码序列，更常称为翻译起始序列。该序列被修饰，也就是说它具有至少一个与一般群体观察到的相同序列不同的核苷酸，-与待筛选的所述干扰核酸的序列至少部分互补的第二序列，其对应于一种或多种干扰核酸的靶序列，以及-编码至少一种确定肽的第三核苷酸序列，该肽可能对应于免疫原性标签，或者对应于具有酶活性的功能性蛋白质，或具有发光或荧光性质的蛋白质。在本专利技术中，第二序列可以包含在第三序列内。这意味着编码所述至少一种确定肽的第三序列包含至少部分的、与待筛选的干扰核酸序列至少互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选干扰核酸方法，所述干扰核酸增加：‑基因表达和/或‑基因和/或从所述基因转录的核糖核酸的活性，所述干扰核酸与所述基因或所述RNA具有至少部分序列互补性，并且所述方法包括将杂合核酸分子，特别是能够进行RNA干扰的，引入真核细胞的步骤，所述杂合核酸分子包括：‑用于启动翻译的第一非编码序列，‑与待筛选的所述干扰核酸的序列至少部分互补的第二序列，‑编码至少一种确定肽的第三核苷酸序列，所述第三序列处于第一序列的顺式翻译控制下，所述第一序列被修饰，通过取代、缺失或添加至少一个核苷酸，使得所述至少一种肽的翻译水平相对于在其未修改、特别优选形式的所述第一序列控制下的所述至少一种肽的翻译水平降低至少10％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.26 FR 14591511.一种筛选干扰核酸方法，所述干扰核酸增加：-基因表达和/或-基因和/或从所述基因转录的核糖核酸的活性，所述干扰核酸与所述基因或所述RNA具有至少部分序列互补性，并且所述方法包括将杂合核酸分子，特别是能够进行RNA干扰的，引入真核细胞的步骤，所述杂合核酸分子包括：-用于启动翻译的第一非编码序列，-与待筛选的所述干扰核酸的序列至少部分互补的第二序列，-编码至少一种确定肽的第三核苷酸序列，所述第三序列处于第一序列的顺式翻译控制下，所述第一序列被修饰，通过取代、缺失或添加至少一个核苷酸，使得所述至少一种肽的翻译水平相对于在其未修改、特别优选形式的所述第一序列控制下的所述至少一种肽的翻译水平降低至少10％。2.如权利要求1所述的方法，其中所述杂合核酸分子包括位于所述第三序列上游的所述第一序列。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是任选地包含在载体中的脱氧核糖核酸，特别是双链的分子，或核糖核酸分子，特别是单链的分子。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一序列是其未修饰形式、由以下列序列表示的Kozak序列：5'-ssmRccA(T/U)GG-3'(SEQIDNO:1)其中R表示嘌呤，s表示G或C，和m表示A/U或C。5.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述第一序列是Kozak序列，所述Kozak序列包含以其修饰形式的以下序列或由以下序列组成：SEQIDNO：4或SEQIDNO：NO：5中的一个。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二序列包含与所述干扰核酸的序列至少部分互补的18至10,000个核苷酸。7.一种杂合核酸分子，其包含：-用于启动翻译的...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克·比安弗尼，
申请(专利权)人：法国国家科研中心，蒙彼利埃大学，
类型：发明
国别省市：法国,FR