熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，包括：1)、将熊蜂PGRP‑SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。本发明专利技术对熊蜂PGRP‑SA蛋白表达条件进行了优化，优选了各过程中重要试剂的配方，结合采用层析法复性，方法简单快速，操作过程温和，对蛋白损伤小，获得了高纯度的活性蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法。
技术介绍
昆虫作为地球上种类最多的动物，目前已知的约有100万种，它们大多生活在充满病原微生物的恶劣环境中，在长期的进化选择压力下昆虫形成了一套独特的免疫防御体系来对抗这些病原微生物的入侵。昆虫缺乏获得性免疫，仅依靠先天免疫作为其防御机制。对于外来入侵的病原微生物来说，昆虫通过先天免疫进行抵抗，第一步是通过模式识别受体识别病原相关分子模式，从而激活下游反应。在昆虫中作为模式识别受体的有：肽聚糖识别蛋白(PeptidoglycanRecognitionProteins，PGRPs)、β-葡聚糖识别蛋白(β－GlucanRecognitionProteins，β－GRP)以及革兰氏阴性菌结合蛋白(Gram－neg－ativeBindingProtein，GNBP)，但其中最主要的模式识别受体是肽聚糖识别蛋白。PGRPs最初于家蚕的血淋巴中被发现，此蛋白结合细菌肽聚糖并激活酚氧化酶原级联反应-昆虫宿主抗菌防御机制。PGRP-SA为分泌型PGRPs，识别革兰氏阳性菌或真菌细胞壁肽聚糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP‑SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。

【技术特征摘要】
1.一种熊蜂肽聚糖识别蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、将熊蜂PGRP-SA的基因片段连接表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，收集表达得到的包涵体蛋白；2)、将所述包涵体蛋白洗涤后加入蛋白变性剂溶解，随后用复性液进行复性处理；3)、将蛋白浓缩后依次经分子筛柱和阴离子交换柱洗脱纯化。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述熊蜂PGRP-SA的基因片段的获取方法为：以熊蜂cDNA为模板，以SEQIDNO:2所示的上游引物和SEQIDNO:3所示的下游引物进行扩增；优选的，退火温度为57℃～59℃，循环次数为28～32次。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为PET21a+载体。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，洗涤所述包涵体蛋白时所用的洗涤液选自洗涤液A和/或洗涤液B；所述洗涤液A的成分包括0.4％～0.6％(v/v)Triton-100，45～55mMTris-Cl，280～320mMNaCl，8～12mMEDTA-Na2，8～12mMDTT，pH＝7.8～8.2；所述洗涤液B的成分包括45～55mMTris-Cl，80～120mMNaCl，8～12mMEDTA-Na2，8～12mMDTT，pH＝7.8～8.2；优选的，用洗涤液A洗涤1～3次后再用洗涤液B洗涤1～2次。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白变性剂中包含5～7mol的盐酸胍；优选的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彦杰，安建东，黄家兴，孙成，丁桂玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11