一种基于数字PCR定量检测病毒的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种基于数字PCR定量检测病毒的方法。本发明专利技术一种基于数字PCR定量检测病毒的方法，包括(1)待检样品前处理；(2)微滴制备；(3)PCR扩增反应；(4)检测微滴。本发明专利技术无需在PCR检测之前对核酸进行提取，避免了病毒核酸在提取过程中的损失，更加准确的测定出病毒含量；同时，本发明专利技术的方法在微滴制备时将配制好的PCR水相和PCR油相同时放料，分别瞬时控制PCR水相和PCR油相的流量，且混合的同时在摇床上涡旋搅拌并反应得到的油包水微滴的粒径为100nm‑1μm，平均粒径小，微滴大小均一稳定，每个样品形成的液滴个数显著增加，检测结果的准确度大大提高。

A method for quantitative detection of viruses based on digital PCR

The invention relates to the technical field of biology, in particular to a method for quantitative detection of viruses based on digital PCR. The invention relates to a method for quantitative detection of viruses based on digital PCR, which comprises (1) pretreatment of sample to be examined; (2) preparation of micro drops; (3) PCR amplification reaction; (4) detecting micro drops. The invention relates to a detection of nucleic acid in PCR before extraction, to avoid the loss of the viral nucleic acid in the extraction process, more accurate determination of the virus content; at the same time, the method of the invention will be prepared in the droplet when preparing PCR aqueous and oil phase and PCR discharge, respectively PCR phase and instantaneous control PCR oil phase flow, and at the same time mixed shake vortex stirring and reaction of the oil droplet size w / O 100nm 1 m, the average particle size of small droplet size, uniform and stable, each sample droplets formed a significant increase in the number of test results, the accuracy is greatly improved.

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR定量检测病毒的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于数字PCR定量检测病毒的方法。
技术介绍
在核酸的体外检测领域，荧光定量PCR(qPCR)方法无疑是最主要的分子检测手段之一，其中包括了对病毒分子的定性和定量分析。在对病毒核酸进行定量的过程中，病毒核酸的提取和纯化是非常关键的步骤，该步骤的主要目的之一为将病毒的核酸分子从蛋白类的衣壳内释放出来，满足下游检测的需要；目的之二为去除样品中对下游PCR反应有抑制作用的各种PCR抑制剂。但在实际操作过程中，不同的纯化方法及核酸提取试剂盒在上述两方面的表现是不尽相同的。正由于此，qPCR对于病毒的定量结果往往与真实值存在差异且实验室间结果的一致性较差(inter-laboratoryvariability)。因此，针对某些病毒专门制备了完整病毒的标准品(Whole-virusreferencematerials)。利用这类标准品可以用来归一化核酸制备前处理过程及qPCR检测体系的差异，从而提高病毒分子检测结果的可比性。目前这类标准品的载量还是通过qPCR的方法进行测定，对多个实验室得到的qPCR结果取平均值获得，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数字PCR定量检测病毒的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤一：待检样品前处理；步骤二：微滴制备：配制PCR水相，PCR水相包括1.6％～2％上游引物、1.6％～2％下游引物、0.2％～0.4％PCR模板、20％～30％PCRmix仪次均匀混合，滴加70％～80％双蒸水后将溶液体系作为反应水相备用；配制PCR油相，将65％‑68％的甘油、5％‑10.5％的Trition X‑100、5％‑10.5％的司盘60、10％‑20％的辛癸酸甘油酯依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；分别取水相PCR和油相PCR油相按流量比为1:3.5～1:1.5的比例在线混合，混合的同时在摇床上涡旋...

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR定量检测病毒的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤一：待检样品前处理；步骤二：微滴制备：配制PCR水相，PCR水相包括1.6％～2％上游引物、1.6％～2％下游引物、0.2％～0.4％PCR模板、20％～30％PCRmix仪次均匀混合，滴加70％～80％双蒸水后将溶液体系作为反应水相备用；配制PCR油相，将65％-68％的甘油、5％-10.5％的TritionX-100、5％-10.5％的司盘60、10％-20％的辛癸酸甘油酯依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；分别取水相PCR和油相PCR油相按流量比为1:3.5～1:1.5的比例在线混合，混合的同时在摇床上涡旋搅拌并反应，得到油包水微滴；步骤三：PCR扩增反应，将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后设定PCR反应条件进行PCR扩增；步骤四：检测微滴，PCR反应后，将96孔PCR板置于QX10...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，李佳蓬，覃欢，项园，姚奥，李慧，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42