一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用。重组毕赤酵母通过向含4拷贝数pro‑rml基因的能够表达Pro‑RML的重组巴斯德毕赤酵母X‑33中转化过表达HAC1基因的质粒HAC1‑pPIC3.5K得到。该菌株摇瓶发酵96h时，胞外酶活最高达到1078U/mL，酶活分泌效率达到47U/OD600。而专利CN103361327A涉及的2个米黑根毛霉脂肪酶拷贝数的毕赤酵母达到最高胞外酶活及酶的分泌效率需要发酵120h，胞外酶活最高为1038U/mL，酶活分泌效率仅为25U/OD600。本发明专利技术有效的促进了米黑根毛霉脂肪酶的表达，在不影响胞外最高酶活的情况下，使米黑根毛霉脂肪酶的分泌效率提高了1.9倍，且发酵时间缩短了24h。

Recombinant Pichia pastoris with heterologous expression of lipase and its application

The invention discloses a recombinant Pichia pastoris with highly heterologous expression of lipase and an application thereof. To express with 4 copies of Pro RML gene can express Pro RML Pasteur recombinant Pichia pastoris X 33 transformed HAC1 gene plasmid HAC1 pPIC3.5K obtained by recombinant Pichia pastoris. The strain 96h of shake flask fermentation, extracellular enzyme activity reached 1078U/mL, enzyme secretion efficiency reached 47U/OD600. 120h needs CN103361327A patent fermentation involves 2 copies of Rhizomucor miehei lipase in Pichia pastoris reached the highest extracellular enzyme activity and enzyme secretion efficiency, extracellular enzyme activity was highest in 1038U/mL, enzyme secretion efficiency is only 25U/OD600. The invention can promote the expression of Rhizomucor miehei lipase, without affecting the extracellular enzyme activity under the condition of the highest, the secretion efficiency of Rhizomucor miehei lipase was increased by 1.9 times, and shorten the fermentation time of 24h.

【技术实现步骤摘要】
一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一株异源高效表达脂肪酶的重组毕赤酵母及其应用。
技术介绍
脂肪酶(EC3.1.1.3)是可以水解三酰甘油的一类酶，可催化多种化学反应如：水解、酯化、转酯化、氨解等，且具有反应条件温和、专一性强、无污染等优点被广泛的应用于食品、医药、化妆品、石油等行业，被称之为第三大工业用酶。脂肪酶虽然用途广，但出发菌株产量低，限制其应用，因此异源蛋白表达是当前蛋白工业化生产的主要策略。但异源蛋白表达时的影响因素很多，如宿主的选择、基因密码子的偏爱性、基因拷贝数、载体的性能、培养条件、宿主自身蛋白合成分泌途径的承受能力等等。多种限制因素的存在使多数酶的表达量仍旧很低，单一因素的改造也不能有效地提高酶的表达水平。如何提高宿主分泌异源脂肪酶的能力是脂肪酶工业化应用需解决的问题。异源蛋白过表达过程中，为保证蛋白被正确折叠并分泌到胞外，会采取一系列质量控制措施。如当大量的新生肽或未折叠的蛋白在内质网中积累时，会激发解折叠蛋白反应(UPR反应)，UPR反应可增强蛋白折叠及降解途径的相关基因的表达，使未折叠蛋白折叠且错误折叠蛋白降解，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌通过向含4拷贝数pro‑rml基因的能够表达Pro‑RML的重组巴斯德毕赤酵母X‑33中转化过表达HAC1基因的质粒HAC1‑pPIC3.5K得到。

【技术特征摘要】
1.一种高效异源分泌表达米黑根毛霉脂肪酶的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌通过向含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33中转化过表达HAC1基因的质粒HAC1-pPIC3.5K得到。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述的含4拷贝数的pro-rml基因的重组巴斯德毕赤酵母X-33是通过将含前导肽的脂肪酶基因pro-rml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA上构建得到含2拷贝pro-rml基因的表达载体pPICZαA-2prorml；将pPICZαA-2prorml转化到巴斯德毕赤酵母X-33中通过qPCR法筛选获得含4拷贝数pro-rml基因的能够表达Pro-RML的重组巴斯德毕赤酵母X-33；其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金金，王一洲，孙梦雪，郑维发，赵艳霞，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32