一种长效干扰素及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术研究领域，具体涉及一种长效干扰素及其制备方法。所述的长效干扰素由干扰素与链球菌G蛋白C2结构域组成，其制备方法包括融合表达载体构建、融合干扰素表达与纯化、纯化标签切除和融合干扰素回收。与现有的重组干扰素相比，本发明专利技术的长效干扰素具有制备工艺简单、成本低和半衰期长等优点，可以用于人和动物长效干扰素的制备。

Long-acting interferon and preparation method thereof

The invention belongs to the technical field of biological technology, in particular to a long-acting interferon and a preparation method thereof. The long-acting interferon by interferon and streptococcal G protein C2 domain composition, its preparation method includes the fusion expression vector construction, expression and purification of interferon fusion, resection and fusion interferon recovery purification tag. Compared with the existing recombinant interferon, the long-acting interferon has the advantages of simple preparation process, low cost and long half-life, and can be used for the preparation of long-acting interferon for human and animals.

【技术实现步骤摘要】
一种长效干扰素及其制备方法
本专利技术涉及生物技术研究领域，具体涉及一种长效干扰素及其制备方法。
技术介绍
干扰素是病毒病的有效治疗药物和肿瘤的辅助治疗药物。现有重组干扰素多为大肠杆菌表达的组氨酸标签融合蛋白，需要用亲和柱纯化。亲和柱不仅价格较贵，而且难以规模化制备。类弹性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptide,ELP)是根据弹性蛋白重复序列合成的聚合分子，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈可溶状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态。因此，ELP融合蛋白不仅可在特定温度下用简单的离心法进行分离纯化，而且纯化效率与亲和层析法相当。由于分子量较小(15kDa左右)和易被体内清除，干扰素的半衰期较短，治疗慢性疾病时需要反复注射。延长干扰素半衰期的策略主要有聚乙二醇化和与血清白蛋白等融合。其中，聚乙二醇化工艺相对简单，但反应程度较难控制，不仅影响干扰素活性，而且有一定的副作用；血清白蛋白融合干扰素的活性稳定，但纯化程序较复杂、成本较高。链球菌G蛋白(SPG)是免疫球蛋白IgG结合蛋白，其IgG结合区含C1、C2和C3结构域，其中C2结构域足以与人和多种动物的IgG结合。因此，SPGC2结构域融合干扰素可通过与IgG结合而增大分子量、延长半衰期。多数重组蛋白均需切除融合标签后才有生物活性，常用的策略是先向目的蛋白引入蛋白酶切位点，在纯化获得重组蛋白后，再用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)等切除融合标签。这种策略不仅需要价格昂贵的蛋白酶，还需用额外的亲和层析等步骤去除蛋白酶。本专利技术将干扰素与ELP、肝片吸虫Fh8蛋白和SPGC2结构域进行融合表达，用TEVP活性包涵体切割ELP-Fh8融合标签，获得的IFN-C2融合干扰素能通过与IgG结合而延长半衰期。尽管这种策略在理论上是可以想得到的，但在设计时面临以下具体问题：此融合蛋白能否在大肠杆菌中高效表达？其分离纯化和标签切除的最佳条件是什么？IFN-C2融合干扰素能否与IgG结合？其生物活性及半衰期如何？
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种长效干扰素制备方法。本专利技术的长效干扰素由干扰素与SPGC2结构域组成，经体外结合证明能与人和多种动物IgG结合，经血浆稳定性试验证明半衰期显著延长。本专利技术所述的长效干扰素，用下列方法制备：(1)将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体，获得pELP-Fh8载体；(2)将SPGC2结构域编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列插入pELP-Fh8载体，获得pELP-Fh8-C2载体；(3)将干扰素成熟肽编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，5'端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)识别位点，将合成序列插入pELP-Fh8-C2载体，获得重组载体pELP-Fh8-IFN-C2；(4)将重组载体转化大肠杆菌，在低温用IPTG诱导融合蛋白表达；(5)在优化条件下，用温度敏感的相变循环纯化融合蛋白；(6)用TEVP活性包涵体消化ELP-Fh8-IFN-C2融合蛋白，用离心法去除TEVP活性包涵体；(7)用相变循环去除ELP-Fh8标签，用低浓度尿素溶解IFN-C2融合干扰素。优选地，步骤(1)中Fh8编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQIDNo.1所示；步骤(2)中SPGC2编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQIDNo.4所示；步骤(3)中干扰素肽编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如SEQIDNo.7所示；步骤(5)中所述优化条件是裂解重组菌蛋白浓度为10mg/mL，相变温度为28℃，孵育时间为10min，初次相变循环氯化钠浓度为3M，再次相变循环氯化钠浓度为2.5M，12000g室温5min。用免疫印迹法检测本专利技术制得的IFN-C2融合干扰素与免疫球蛋白结合，用病变抑制法测定融合干扰素的抗病毒活性，用血浆稳定性试验测定融合干扰素的半衰期。实验表明IFN-C2融合干扰素能与人和动物IgG结合，半衰期显著延长。与其他方法相比，本专利技术的长效干扰素制备方法具有简单、经济等优点，适合人和动物长效干扰素的制备。附图说明图1.长效干扰素表达载体的结构示意图。PT7代表T7启动子；ELP、Fh8、IFNa和SPGC2分别代表类弹性蛋白多肽、Fh8蛋白、干扰素和SPGC2结构域编码序列。图2.融合蛋白的纯化及电泳分析。M代表蛋白分子量标准；1为未纯化重组菌裂解液；2为初次相变循环纯化产物；3为再次相变循环纯化产物。图3.融合干扰素的标签切除与回收。M为蛋白分子量标准；1为TEVP酶切产物；2为离心上清；3为回收的PoIFNα-C2融合干扰素。图4.融合干扰素的免疫球蛋白亲和性检测。M为蛋白分子量标准；1-7分别为猪、牛、鼠、羊、兔、人、鸭的IgG。具体实施方式生物材料：1.pET-ELP载体：本实验室构建(文献：Wen-JunLiu,QianWu,BiXu,Xin-YuZhang,Xiao-LiXia,Huai-ChangSun.Single-steppurificationofrecombinantproteinsusingelastin-likepeptide-mediatedinversetransitioncyclingandself-processingmodulefromNeisseriameningitidesFrpC.ProteinExpressionandPurification,2014,98:18-24)。2.DH5α大肠杆菌：从美国BDBiosciencesClontech公司引进，本实验室保存。3.BL21(DE3)大肠杆菌：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。4.MDBK细胞：从美国ATCC引进，本实验室保存。5.水泡性口炎病毒(VSV)：由本实验室保存(文献：徐耀先，周晓峰，刘立德.分子病毒学.武汉：湖北科学技术出版社，2000.300-302)。6、pUC57载体：购于金斯瑞生物科技(南京)有限公司。具体实施步骤如下：1.表达载体构建(1)用JAVACodonAdaptionTool(文献：GroteA,HillerK,ScheerM,MünchRB,HempelDC,JahnD.JCat:anoveltooltoadaptcodonusageofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.NucleicAcidsResearch,2005，1:33)，将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列(GenBankAF213970)优化为大肠杆菌(K12株)密码子序列(SEQIDNo.1)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，插入pUC57载体。5-CATATGCCGTCTGTTCAGGAAGTTGAAAAACTGCTGCACGTTCTGGACCGTAACGGTGACGGTAAAGTTTCTGCTGAAGAACTGAAAGCTTTCGCTGACGACTCTAAATGCCCGCTGGACTCTAACAAAATCAAAGCTTTCATCAAAGAACACGACAAAAACAAAGACGGTAAACTGGACCTGAAAGAACTGGTTTCTATCCTGTCTTCTGCAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种的长效干扰素，其特征在于：由干扰素与链球菌G蛋白(SPG)C2结构域组成。

【技术特征摘要】
1.一种的长效干扰素，其特征在于：由干扰素与链球菌G蛋白(SPG)C2结构域组成。2.一种权利要求1所述的长效干扰素的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)将肝片吸虫Fh8蛋白编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体，获得pELP-Fh8载体；(2)将SPGC2结构域编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列插入pELP-Fh8载体，获得pELP-Fh8-C2载体；(3)将干扰素成熟肽编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，5'端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)识别位点，将合成序列插入pELP-Fh8-C2载体，获得重组载体pELP-Fh8-IF...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙怀昌，谭笑，孙永越，夏文龙，张鑫宇，夏晓莉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32