由靶向测序进行数字测量制造技术

本文公开用于将多个核酸内的一或多个特定核酸定量的方法、组合物和试剂盒。在一些实施例中，自对所述特定核酸具有特异性的富集探针延伸产物构筑测序库并且测序。在一些实施例中，所得读段用于去除重复读段。在一些实施例中，经验证探针的计数用于定量或确定初始核酸样品中的特定核酸分子的数目。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由靶向测序进行数字测量
本专利技术教示涉及使用引起数字测量的靶向核酸测序用于基因表达和拷贝数变异。相关申请的交叉引用本申请要求2014年8月6日递交的美国临时申请第62/034,043号的权益，所述申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
提供特定核酸的数字计数的分子方法为研究和临床团体所关注。这些方法可用于离散地测量基因表达(数字基因表达或DGE)或拷贝数变异(CNV)。可通过数字读出获得的精确测量与微阵列技术相比提供数据的较高置信度并且允许研究人员鉴定样品之间的较小差异或类似地，细胞子组内的差异(如在肿瘤活检以及测定细胞到细胞变异中)。然而，仍需要用于选择性标靶定量的允许在无专门仪器的情况下进行所关注转录组和基因组区的高通量分析的不同方法。本文中所公开的方法、组合物和试剂盒满足这些需要并且提供相关优势。
技术实现思路
在一个方面中，公开一种将多个核酸内的多个特定核酸定量的方法，其包含：a.产生多个探针延伸产物的测序库，其中各探针延伸产物可由延伸与特定核酸序列内的探针标靶区互补和杂交的探针获得；b.将包含多个探针延伸产物的库测序以产生多个探针延伸产物的序列数据；及c.将比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将组合物中的多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.产生多个探针延伸产物，其中各探针延伸产物包含与特定核酸分子内的探针标靶区互补的探针序列；b.将所述多个探针延伸产物测序以产生所述多个探针延伸产物中的每一者的序列；c.将所述多个探针延伸产物中的每一者的所述序列与参考序列数据库比对，其中所述参考序列数据库包含探针序列；及d.测定各探针延伸产物的所述序列与所述参考序列数据库中的序列的比对数目，其中所述比对数目指示与所述探针延伸产物的所述探针互补的所述特定核酸分子中的每一者的数量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.06 US 62/034,0431.一种将组合物中的多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.产生多个探针延伸产物，其中各探针延伸产物包含与特定核酸分子内的探针标靶区互补的探针序列；b.将所述多个探针延伸产物测序以产生所述多个探针延伸产物中的每一者的序列；c.将所述多个探针延伸产物中的每一者的所述序列与参考序列数据库比对，其中所述参考序列数据库包含探针序列；及d.测定各探针延伸产物的所述序列与所述参考序列数据库中的序列的比对数目，其中所述比对数目指示与所述探针延伸产物的所述探针互补的所述特定核酸分子中的每一者的数量。2.一种将多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.产生多个探针延伸产物，其中各探针延伸产物包含(i)第一衔接子，和(ii)与特定核酸分子内的探针标靶区互补的探针序列；b.将所述多个探针延伸产物测序以产生包含所述多个探针延伸产物中的每一者的序列的序列数据；c.鉴定所述序列数据内各探针延伸产物的所述探针序列的存在；及d.测定所述多个探针延伸产物内的所述探针序列中的每一者的数目，其中所述探针序列中的每一者的所述数目指示与所述探针序列中的每一者互补的所述多个特定核酸分子中的每一者的数量。3.一种将多个核酸分子内的多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.将第一衔接序列附接到多个核酸分子中的每一者的5'端；b.将多个探针与所述多个特定核酸分子杂交，其中各探针与特定核酸分子内的探针标靶区互补；c.将各探针延伸到所述附接的第一衔接序列中以产生多个具有所述第一衔接序列和第二衔接序列的探针延伸产物以产生多个探针延伸产物；d.将所述多个探针延伸产物测序以产生所述多个探针延伸产物中的每一者的序列数据；e.将所述多个探针延伸产物中的每一者的序列与探针数据库的参考拷贝内的预定序列比对，其中所述预定序列对各探针具有特异性；及f.测定与其预定序列比对的各探针序列的数目，其中所述数目指示与所述探针互补的所述特定核酸分子的数量。4.一种将多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.延伸多个探针，其中各探针与所述多个特定核酸分子内的特定核酸分子内的探针标靶区杂交并且各探针在其5'端具有第一衔接子，以产生多个延伸产物；b.将第二衔接子附接到所述多个探针延伸产物的双链端；c.将所述多个探针延伸产物测序以产生所述探针延伸产物中的每一者的序列数据；及d.测定与探针标靶区杂交的各探针的数目，其中所述数目指示包含所述探针标靶区的所述特定核酸分子中的每一者的数量。5.一种将组合物中的多个特定核酸分子定量的方法，其包含：a.将多个探针与特定核酸分子内的探针标靶区杂交，其中各探针在其5'端具有第一衔接子；b.延伸各探针以产生多个包含所述第一衔接序列的探针延伸产物；c.将第二衔接序列附接到所述多个探针延伸产物的双链端；d.将所述多个探针延伸产物测序以产生所述多个探针延伸产物中的每一者的序列；e.将所述多个探针延伸产物中的每一者的所述序列与探针数据库内的预定序列比对，其中所述探针数据库包含多个预定序列，其中各预定序列对探针具有特异性；及f.测定各探针延伸产物的所述序列与所述测序数据库内的预定序列的比对数目，其中所述比对数目指示与所述探针杂交的所述特定核酸分子中的每一者的数量。6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述多个探针延伸产物的所述序列包含正向读段、索引读段和反向读段中的至少一者。7.根据权利要求6所述的方法，其中验证各探针退火到其相应特定核酸内的其相应探针标靶区序列的特异性。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个探针延伸产物的所述序列映射到基因组或转录组的坐标以验证预期探针退火和延伸。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个探针延伸产物的所述序列映射到基因组或转录组的坐标。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述多个探针延伸产物的所述序列与探针数据库的参考拷贝比对以验证预期探针退火和延伸。11.根据权利要求6所述的方法，其中所述反向读段包含所述探针标靶区。12.根据权利要求6所述的方法，其中所述正向读段包含所述探针标靶区。13.根据权利要求8和9中任一权利要求所述的方法，其中用于所述正向和反向读段的所述多个探针延伸产物的所述序列针对所述多个特定核酸映射。14.根据权利要求6所述的方法，其中用于所述索引读段的所述多个探针延伸产物的所述序列鉴定样品条形码序列和n-随机序列中的至少一者。15.根据权利要求8所述的方法，其中正向读段映射坐标与索引读段n-随机碱基的组合确定各探针延伸产物的PCR重复。16.根据权利要求15所述的方法，其中具有相同正向读段坐标和相同n-随机碱基序列的序列鉴定为重复，合并并且以单个特定核酸分子形式计数。17.根据权利要求15所述的方法，其中具有相同正向读段坐标但不同n-随机碱基序列的序列各以相异的特定核酸分子形式计数。18.根据权利要求9所述的方法，其中正向读段映射坐标与索引读段n-随机碱基的组合鉴定特定核酸分子。19.根据权利要求18所述的方法，其中具有相同正向读段坐标和相同n-随机碱基序列的序列鉴定为重复，合并并且以单个特定核酸分子形式计数。20.根据权利要求18所述的方法，其中具有相同正向读段坐标但不同n-随机碱基序列的序列各以相异的特定核酸分子形式计数。21.根据权利要求18所述的方法，其中对所述正向读段与对应反向读段进行双末端比对。22.根据权利要求16和19中任一权利要求所述的方法，其中在重复合并之后，针对各探针序列计数的反向读段的数目产生代表所述多个特定核酸内的各初始特定核酸分子的分子数目的值。23.根据权利要求16和19中任一权利要求所述的方法，其中在重复合并之后，针对各探针序列计数的正向读段的数目产生代表所述多个特定核酸内的各初始特定核酸分子的分子数目的值。24.根据权利要求17和19中任一权利要求所述的方法，其中针对各探针序列计数的反向读段的数目产生代表所述多个特定核酸内的各初始特定核酸分子的分子数目的值。25.根据权利要求8和9中任一权利要求所述的方法，其中所述基因组选自由以下组成的群组：哺乳动物、细菌、病毒、立克次体或植物基因组或转录组。26.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳森·斯科尔尼克，道格拉斯·阿莫雷塞，斯特凡妮·C·韦尔加，本杰明·施罗德，
申请(专利权)人：纽亘技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US