文库定量和鉴定制造技术

本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。一些实施例涉及一种文库定量的方法。例如，所述方法可以包含提供DNA片段，在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号，并且基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量。

Library quantification and identification

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】文库定量和鉴定序列表与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为Sequence_listing.txt。该文本文件约为27KB，并通过EFS-Web以电子方式提交。
技术介绍
下一代DNA测序仪通常使用具有已知序列末端的DNA片段。两端具有已知的序列使得DNA片段能够扩增、固定化，并提供测序的起始位置(例如，引发位点)。已知序列的末端通常称为衔接子；其根据测序仪的需要调整DNA片段。并非溶液中所有DNA片段的每一端均具有用于序列测定的衔接子。使用两种不同引物的PCR扩增步骤(每种引物对衔接子之一具有特异性)通常用于富集末端具有两个不同衔接子的片段。末端具有衔接子的DNA片段的这种集合通常被称为文库。这些文库可以固定在固相支持体上，使得文库元素(例如，其间插入不同DNA片段的衔接子)之间的空间距离允许单个元素彼此之间的可视化(检测)和识别。元素之间的距离变得更加关键，因为必须在表面上扩增个别元素以增加其数量，并允许片段测序时有效检测荧光团。这种扩增通常被称为桥式扩增，并产生通常被称为簇的结果。随着片段的扩增，具有相同序列的片段簇在支持体上产生。对于簇中待测定的DNA的序列，所述簇是同质的并且不包含来自任何其它文库元素的DNA。如果簇之间太过紧密或在极端情况下发生重叠，则图像分析软件可能难以区分簇的边界，并且难以将其组合为单个特征以进行数据提取。由于此簇的数据来自具有两个不同序列的两个不同DNA片段，因此软件可能无法准确测定序列。如果这些簇相距更远，则可以分别分析每个簇并准确测定序列。如果这些簇相距太远，则测序变得低效。处理样品的成本是固定的，但是每个簇的成本会增加。由于簇的间距由个别文库元素的浓度决定，因此需要准确地测定这些文库元素的浓度。
技术实现思路
本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。一些实施例涉及一种文库定量的方法。例如，所述方法可以包含提供DNA片段，在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号，并且基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量。在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含扩增的DNA片段的基于荧光的测序的步骤。在一些实施例中，可以通过使用荧光计检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段的数量与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。一些实施例涉及一种核酸文库，其包含各自仅连接预定数量荧光团的DNA片段，使得基于由连接的DNA片段产生的荧光信号来计算DNA片段的数量。在一些实施例中，DNA片段是使用引物产生的PCR扩增子，每种引物用荧光团标记，使得仅预定数量的荧光团连接到每个PCR扩增子片段。在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。一些实施例涉及一种对DNA样品进行测序的方法。例如，所述方法可以包含使用DNA样品产生DNA片段，以及在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由扩增的DNA片段产生的荧光信号，基于检测到的荧光信号计算扩增的DNA片段的数量，将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度，以及使用基于荧光的测序技术对扩增的DNA片段的至少一部分进行测序。在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。在一些实施例中，可以通过使用荧光计检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段的数量与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。一些实施例可以进一步包含试剂盒，所述试剂盒包含能够连接到DNA片段的衔接子和与所述衔接子互补的引物。每种引物可以用荧光团标记，使得使用引物扩增所述DNA片段以便将每个片段仅与预定数量的荧光团连接。在一些实施例中，试剂盒可以包含一或多种聚合酶。在一些实施例中，试剂盒可以包含用于扩增的试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含用于测序的试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含使用试剂盒的书面说明。在一些实施例中，试剂盒可以包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP或其任何混合物。附图说明参照附图进行详细描述。在附图中，附图标记最左侧的一或多个数字标识附图标记首次出现的附图。不同附图中相同的附图标记表示类似或相同的项。图1示出了文库定量的实例。图2示出了文库定量的另一个实例。图3示出了文库定量的又一个实例。具体实施方式本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。本公开的实施例涉及一个惊人的发现，即将荧光染料附着到DNA片段上进行文库定量和鉴定不会干扰随后的序列测定。在一些实施例中，附着有荧光染料的引物用于文库定量和鉴定。当附着有荧光染料的引物保留在文库中时，可以使用基于荧光的测序技术对文库进行随后测序。已经报告了用于定量NGS文库的各种方法。一些方法依赖于文库元素的电泳分离以及不同长度的片段的定量(曲线下面积评估)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种文库定量的方法，所述方法包括：/n提供DNA片段；/n在存在至少一种引物的情况下，通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段，其中至少一种引物用荧光团标记，导致预定数量的荧光团连接到每个扩增的DNA片段；/n检测从所述扩增的DNA片段产生的荧光信号；/n基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量；以及/n通过将所述扩增的DNA片段稀释到预定浓度来准备进行固相连接。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种文库定量的方法，所述方法包括：
提供DNA片段；
在存在至少一种引物的情况下，通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段，其中至少一种引物用荧光团标记，导致预定数量的荧光团连接到每个扩增的DNA片段；
检测从所述扩增的DNA片段产生的荧光信号；
基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量；以及
通过将所述扩增的DNA片段稀释到预定浓度来准备进行固相连接。


2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号之前，
去除未掺入到所述扩增的DNA片段中的引物，以准备进行荧光测序。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种引物包括第一引物类型和第二引物类型，并且所述第一引物类型具有单个连接的荧光团。


4.根据权利要求1所述的方法，其中单个荧光团连接到每个DNA片段。


5.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号包括使用荧光计检测由掺入到所述扩增的DNA片段中的荧光团产生的所述荧光信号。


6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
产生指示源自参考样品的DNA片段的数量与由所述DNA片段产生的荧光信号之间的关系的标准曲线。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基于所述检测到的信号计算所述扩增的DNA片段的数量包括基于所述检测到的荧光信号和所述标准曲线计算所述扩增的DNA片段的数量。


8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
进行第二测量以确定所述扩增的DNA片段的特性。


9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：确定样品中DNA的总质量。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增的DNA片段的特性包括所述扩增的DNA片段的平均大小，所述平均大小源自片段的数量与DNA质量之间的比率。


11.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段包括至少一个衔接子，并且所述引物与所述衔接子互补。


12.一种核酸文库，其包括各自仅连接预定数量的荧光团的DNA片段，使得基于由所连接的荧光团产生的荧光信号计算所述DNA片段的数量。


13.根据权利要求12所述的核酸文库，其中所述DNA片段是使用两种不同的引物产生的PCR扩增子，并且其中一种引物用荧光团标记，使得仅预定数量的荧光团连接到每个PCR扩增子片段。


14.根据权利要求12所述的核酸文库，其中所述DNA片段包括衔接子，并且所述引物与所述衔接子互补。


15.一种对DNA样品进行测序的方法，所述方法包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·阿莫雷塞，B·李，B·G·施罗德，R·A·费克特，
申请(专利权)人：纽亘技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US