使用三肽基肽酶制备醇的方法技术

本发明专利技术提供了用于制备醇的方法，该方法包括：(a)将主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶与原料或其级分在所述原料或其级分发酵之前、期间或之后混合；以及(b)回收醇。本发明专利技术还提供了三肽基肽酶的用途和可通过本发明专利技术的方法获得的醇生产的副产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用三肽基肽酶制备醇的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2014年10月24日提交的美国临时申请62/068,294的优先权权益，该申请在此以引用方式并入。
本专利技术涉及在醇生产，特别是在用于生物燃料生产的生物乙醇生产中使用的三肽基肽酶。
技术介绍
蛋白酶(与肽酶同义)是能够在底物肽、低聚肽和/或蛋白质中切割氨基酸之间的肽键的酶。蛋白酶基于其催化反应机制和涉及催化用活性位点的氨基酸残基而被分成7个家族。丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶为4个主要家族，而苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和未分组的蛋白酶构成其余的3个家族。通常根据优先切割的底物中特定氨基酸之间的键来定义蛋白酶的底物特异性。通常，底物肽中的氨基酸位置相对于易裂键的位置(即，蛋白酶切割的位置)来定义：NH2-……P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’……-COOH使用以上假设的肽示出，易裂键以星号(*)表示，而氨基酸残基以字母“P”表示，残基N-末端相对于易裂键以P1开始并且在从易裂键离开移向N-末端时数量越来越大。氨基酸残基C-末端相对于易裂键以P1’开始，并且移向C-末端残基的数量增大。蛋白酶通常也可基于其底物特异性而被细分为两大类。第一类为内切蛋白酶，其为能够切割肽或蛋白质底物的内部肽键并趋于远离N-末端或C-末端起作用的蛋白分解肽酶。内切蛋白酶的示例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二类蛋白酶是切割位于接近蛋白质或肽底物的C-末端或N-末端的氨基酸之间的肽键的外肽酶。外肽酶类中的某些酶可具有三肽基肽酶活性。此类酶因而能够从底物肽、低聚肽和/或蛋白质的未取代的N-末端切割3个氨基酸片段(三肽)。已知三肽基肽酶从底物的N-末端切割三肽序列，但除在P1和/或P1’位置处具有脯氨酸的键之外。另选地，三肽基肽酶可以是脯氨酸特异性的，并且仅能够切割相对于易裂键具有脯氨酸残基N-末端(即，在P1位置中)的底物。
技术实现思路
在广义方面，本专利技术提供了用于制备醇的方法，该方法包括：(a)混合包含以下氨基酸序列的三肽基肽酶：选自SEQIDNo.29、SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQIDNo.16、SEQIDNo.17、SEQIDNo.18、SEQIDNo.19、SEQIDNo.20、SEQIDNo.21、SEQIDNo.22、SEQIDNo.23、SEQIDNo.24、SEQIDNo.25、SEQIDNo.26、SEQIDNo.27、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.35、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.38、SEQIDNo.39、SEQIDNo.40、SEQIDNo.41、SEQIDNo.42、SEQIDNo.43、SEQIDNo.44、SEQIDNo.45、SEQIDNo.46、SEQIDNo.47、SEQIDNo.48、SEQIDNo.49、SEQIDNo.50、SEQIDNo.51、SEQIDNo.52、SEQIDNo.53、SEQIDNo.54、SEQIDNo.55中的一个或多个氨基酸序列或它们的功能性片段或与其具有至少70％的同一性的氨基酸序列；或者由以下核苷酸序列表达的三肽基肽酶：选自SEQIDNo.56、SEQIDNo.57、SEQIDNo.58、SEQIDNo.59、SEQIDNo.60、SEQIDNo.61、SEQIDNo.62、SEQIDNo.63、SEQIDNo.64、SEQIDNo.65、SEQIDNo.66、SEQIDNo.67、SEQIDNo.68、SEQIDNo.69、SEQIDNo.70、SEQIDNo.71、SEQIDNo.72、SEQIDNo.73、SEQIDNo.74、SEQIDNo.75、SEQIDNo.76、SEQIDNo.77、SEQIDNo.78、SEQIDNo.79、SEQIDNo.80、SEQIDNo.81、SEQIDNo.82、SEQIDNo.83、SEQIDNo.84、SEQIDNo.85、SEQIDNo.86、SEQIDNo.87、SEQIDNo.88、SEQIDNo.89、SEQIDNo.90、SEQIDNo.91、SEQIDNo.92、SEQIDNo.93、SEQIDNo.94或SEQIDNo.95的核苷酸序列中的一种或多种，或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列，或因遗传密码的简并性而不同于这些核苷酸序列的核苷酸序列，或在中等或高严格条件下杂交的核苷酸序列；以及(b)回收醇。在第一方面，本专利技术提供了用于制备醇的方法，该方法包括：(a)将主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶与原料或其级分在所述原料或级分发酵之前、期间或之后混合；以及(b)回收醇。在第二方面，本专利技术提供了主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高醇的收率的用途。在第三方面，本专利技术提供了主要具有外肽酶活性的一种或多种三肽基肽酶用于在醇的制造中提高产醇宿主的发酵能力的用途。在第四方面，本专利技术提供了通过本专利技术的方法可获得的(或获得的)醇生产的副产物。附图说明现在将参考附图而仅以举例的方式描述本专利技术的实施方案，其中：图1示出在200ppm脲发酵中对肽酶而言的乙醇水平。图2示出双剂量发酵中的乙醇水平。图3示出对不同蛋白酶的发酵中的葡萄糖水平。图4示出相比于蛋白酶以400ppm脲发酵的乙醇水平。图5示出400ppm脲发酵的发酵后期乙醇水平。图6示出采用添加的三肽基肽酶发酵的乙醇水平。图7示出发酵中的总葡萄糖释放。图8示发酵和不同的蛋白酶处理中的小糖的浓度。图9示出三肽基肽酶单独或与(酸性真菌内切蛋白酶)组合对乙醇收率的影响。图10示出双剂量发酵速率比较结果。图11示出表达载体pTTT-TRI083的质粒图谱。图12示出表达载体pTTT-pyrG13-TRI071的质粒图谱。内源性的信号序列被来自里氏木霉(Trichodermareesei)酸性真菌蛋白酶(AFP(获得于GenencorDivision,FoodEnzymes))的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替代(参见图12的下部)。图13示出多个三肽基肽酶氨基酸序列之间的比对。示出xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV基序(加框)。具体实施方式本专利技术的一项重要发现在于在醇生产期间使用主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶来提高醇的收率。此外或另选地，另一项发现在于在醇生产期间使用主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶来提高产醇宿主的发酵能力。基于这些发现，本专利技术提供了用于制备醇的方法，该方法包括：(a)将主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶与原料或其级分在所述原料或级分发酵之前、期间或之后混合；以及(b)回收醇。如本文所用，术语“醇”是指作为生物发酵过程的结果产生的任何醇。醇可例如为乙醇和/或丁醇。优选地，醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备醇的方法，所述方法包括：(a)将主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶与原料或其级分在所述原料或其级分发酵之前、期间或之后混合；以及(b)回收醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.24 US 62/068,2941.一种用于制备醇的方法，所述方法包括：(a)将主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶与原料或其级分在所述原料或其级分发酵之前、期间或之后混合；以及(b)回收醇。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述三肽基肽酶由产醇宿主表达和分泌。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述产醇宿主共表达三肽基肽酶和选自以下的酶中的一种或多种：葡糖淀粉酶、淀粉酶、另外的淀粉改性酶、蛋白酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶)以及它们的组合。4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述三肽基肽酶对所述产醇宿主是异源的。5.主要具有外肽酶活性的三肽基肽酶用于在醇的制造中提高醇的收率的用途。6.主要具有外肽酶活性的一种或多种三肽基肽酶用于在醇的制造中提高产醇宿主的发酵能力的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其中通过与未和三肽基肽酶混合的所述产醇宿主在发酵期间消耗的糖(例如葡萄糖)的水平相比，所述产醇宿主在发酵期间消耗的糖(例如葡萄糖)的量的增大来评估所述产醇宿主发酵的能力。8.根据权利要求5至7中任一项所述的用途，其中将所述一种或多种三肽基肽酶与内切蛋白酶组合使用。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述三肽基肽酶为外肽酶。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述三肽基肽酶为木霉属(Trichoderma)三肽基肽酶。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述三肽基肽酶能够从在位置P1和/或P1’处具有脯氨酸的肽的N-末端切割三肽。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述三肽基肽酶能够从在P1处具有脯氨酸；以及在P1处具有选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的N-末端切割三肽；和/或能够从在P1’处具有脯氨酸；以及在P1’处具有选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸的氨基酸的肽的N-末端切割三肽。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中至少一种耐脯氨酸三肽基肽酶：(a)包含氨基酸序列SEQIDNo.29、SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQIDNo.16、SEQIDNo.17、SEQIDNo.18、SEQIDNo.19、SEQIDNo.20、SEQIDNo.21、SEQIDNo.22、SEQIDNo.23、SEQIDNo.24、SEQIDNo.25、SEQIDNo.26、SEQIDNo.27、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.35、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.38、SEQIDNo.39、SEQIDNo.40、SEQIDNo.41、SEQIDNo.42、SEQIDNo.43、SEQIDNo.44、SEQIDNo.45、SEQIDNo.46、SEQIDNo.47、SEQIDNo.48、SEQIDNo.49、SEQIDNo.50、SEQIDNo.51、SEQIDNo.52、SEQIDNo.53、SEQIDNo.54、SEQIDNo.55或它们的功能性片段；(b)包含与SEQIDNo.29、SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQIDNo.16、SEQIDNo.17、SEQIDNo.18、SEQIDNo.19、SEQIDNo.20、SEQIDNo.21、SEQIDNo.22、SEQIDNo.23、SEQIDNo.24、SEQIDNo.25、SEQIDNo.26、SEQIDNo.27、SEQIDNo.28、SEQIDNo.30、SEQIDNo.31、SEQIDNo.32、SEQIDNo.33、SEQIDNo.34、SEQIDNo.35、SEQIDNo.36、SEQIDNo.37、SEQIDNo.38、SEQIDNo.39、SEQIDNo.40、SEQIDNo.41、SEQIDNo.42、SEQIDNo.43、SEQIDNo.44、SEQIDNo.45、SEQIDNo.46、SEQIDNo.47、SEQIDNo.48、SEQIDNo.49、SEQIDNo.50、SEQIDNo.51、SEQIDNo.52、SEQIDNo.53、SEQIDNo.54、SEQIDNo.55或它们的功能性片段具有至少70％的同一性的氨基酸；(c)由包含序列SEQIDNo.56、SEQIDNo.57、SEQIDNo.58、SEQIDNo.59、SEQIDNo.60、SEQIDNo.61、SEQIDNo.62、SEQIDNo.63、SEQIDNo.64、SEQIDNo.65、SEQIDNo.66、SEQIDNo.67、SEQIDNo.68、SEQIDNo.69、SEQIDNo.70、SEQIDNo.71、SEQIDNo.72、SEQIDNo.73、SEQIDNo.74、SEQIDNo.75、SEQIDNo.76、SEQIDNo.77、SEQIDNo.78、SEQIDNo.79、SEQIDNo.80、SEQIDNo.81、SEQIDNo.82、SEQIDNo.83、SEQIDNo.84、SEQIDNo.85、SEQIDNo.86、SEQIDNo.87、SEQIDNo.88、SEQIDNo.89、SEQIDNo.90、SEQIDNo.91、SEQIDNo.92、SEQIDNo.93、SEQIDNo.94或SEQIDNo.95的核苷酸序列编码；(d)由与SEQIDNo.56、SEQIDNo.57、SEQIDNo.58、SEQIDNo.59、SEQIDNo.60、SEQIDNo.61、SEQIDNo.62、SEQIDNo.63、SEQIDNo.64、SEQIDNo.65、SEQIDNo.66、SEQIDNo.67、SEQIDNo.68、SEQIDNo.69、SEQIDNo.70、SEQIDNo.71、SEQIDNo.72、SEQIDNo.73、SEQIDNo.74、SEQIDNo.75、SEQIDNo.76、SEQIDNo.77、SEQIDNo.78、SEQIDNo.79、SEQIDNo.80、SEQIDNo.81、SEQIDNo.82、SEQIDNo.83、SEQIDNo.84、SEQIDNo.85、SEQIDNo.86、SEQIDNo.87、SEQIDNo.88、SEQIDNo.89、SEQIDNo.90、SEQIDNo.91、SEQIDNo.92、SEQIDNo.93、SEQIDNo.94或SEQIDNo.95具有至少约70％的序列同一性的核苷酸序列编码；(e)由在中等严格性条件下与SEQIDNo.56、SEQIDNo.57、SEQIDNo.58、SEQIDNo.59、SEQIDNo.60、SEQIDNo.61、SEQIDNo.62、SEQIDNo.63、SEQIDNo.64、SEQIDNo.65、SEQIDNo.66、SEQIDNo.67、SEQIDNo.68、SEQIDNo.69、SEQIDNo.70、SEQIDNo.71、SEQIDNo.72、SEQIDNo.73、SEQIDNo.74、SEQIDNo.75、SEQIDNo.76、SEQIDNo.77、SEQIDNo.78、SEQIDNo.79、SEQIDNo.80、SEQIDNo.81、SEQIDNo.82、SEQIDNo.83、SEQIDNo.84、SEQIDNo.85、SEQIDNo.86、SEQIDNo.87、SEQIDNo.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·米亚斯尼科夫，M·马，S·D·鲍尔，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US