合成子的形成制造技术

除了其它，本公开提供一种组合物，其包括：5’核酸外切酶；链置换聚合酶；和任选地，单链DNA结合蛋白质和/或连接酶。另外还描述形成合成子的多核苷酸组装方法以及用于进行该方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成子的形成
技术介绍
合成生物学依赖于由组分部分构建新的DNA的能力。双链(ds)DNA分子已通过在第一DNA双链的两端产生交错末端得以组装。使用限制性核酸内切酶、或者通过使用核酸外切酶消化、或者通过T4DNA聚合酶，然后杂交，以及任选地将第二DNA双链与第一双链连接，已经实现这一点。在反应混合物中使用核酸外切酶和连接酶的技术还指定使用非链置换聚合酶。
技术实现思路
除了其它，本公开提供一种组合物，其包括：i.5’-3’核酸外切酶；ii.链置换聚合酶；iii.单链(ss)DNA结合蛋白质；和iv.非天然存在的缓冲剂，其中组合物不包括拥挤剂和/或非链置换聚合酶。该组合物可以用于将多核苷酸组装到合成子(synthon)中。取决于出于在包含其自身连接酶的细菌细胞中克隆的目的进行组装，还是出于不包括细菌中克隆步骤的目的进行组装，组合物的实施方式任选地包含连接酶。在先描述的组装方法需要非链置换聚合酶，并进一步额外地需要拥挤剂(crowdingagent)(例如，参见US8,968,999)。与现有技术相反，本专利技术的实施方式表明，当与5’-3’核酸外切酶一起使用时，链置换聚合酶相对于非链置换聚合酶具有优势。相对于包括拥挤剂，这一组合倾向于包括ss结合蛋白质，这与声称拥挤剂的使用比包括使用单链结合蛋白质的替代方案要有效4倍的现有技术教导相反。本专利技术的实施方式提供组合物、方法和试剂盒，其在单步方法中和/或在单一反应容器中提供由包括ds和/或ss核酸分子的寡核苷酸和多核苷酸来组装和克隆功能性基因和合成子的效率得以增加。这些实施方式不依赖于拥挤剂，也不需要非链置换聚合酶用于填充两分子退火之后存在的间隙。例如，当作用于dsDNA的5’-3’核酸外切酶产生可以与来自另一分子的3’ssDNA突出端有效退火的3’ssDNA突出端时，链置换聚合酶可以填充分子退火之后留下的间隙。链置换DNA聚合酶和5’-3’核酸外切酶活性的组合产生在接合位点处或附近包含切口的双链合成子。这一切口可以通过连接酶在体外密封，或者通过内源性细胞连接酶在体内密封。此外，在反应混合物中包括ssDNA结合蛋白质使得能够有效地组装相对低浓度的核酸片段，从而在不损失效率或者不损失接合准确性的情况下节约成本。在一些组合物实施方式中，链置换聚合酶是B族聚合酶。链置换聚合酶应当优选地在相同反应条件下(例如，使用比如图1A～1E中所述的试验)链置换活性大于以聚合酶(ThermoFisher，Waltham，MA)(通常描述为非链置换的)所观察者。在本专利技术的组合物、方法和试剂盒中，主要使用链置换聚合酶的链置换活性。在一些实施方式中，链置换聚合酶可以是非天然存在的，例如，链置换聚合酶可以是突变体。突变体的实例包括具有一个或更多个氨基酸替换的聚合酶，非天然存在的聚合酶可以或者另外是具有不相关氨基酸序列的部分的融合蛋白，其中融合聚合酶在自然界不存在。优选地，链置换聚合酶在50℃或更高下稳定，并且因此可以称作热稳定性链置换聚合酶。在一些情形中，链置换聚合酶是具有不相关或异源性DNA结合结构域的融合聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶部分的氨基酸序列与SEQIDNO:102的同一性可以为至少90％或95％或98％或99％。在另一个实施方式中，聚合酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1的同一性可以为至少90％或95％或98％或99％或100％，优选至少90％。在另一个实施方式中，聚合酶的氨基酸序列与SEQIDNO:33至SEQIDNO:55中任意者的同一性可以为至少90％或95％或98％或99％或100％，优选至少90％。在一些实施方式中，DNA结合结构域部分的氨基酸序列与SEQIDNO:2的同一性可以为至少90％或95％或98％或99％。在另一个实施方式中，聚合酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:56至SEQIDNO:96或SEQIDNO:102中任意者的同一性可以为至少90％或95％或98％或99％或100％，优选至少90％。在另一个实施方式中，本文所述的任意聚合酶结构域部分可以与本文所述的任意DNA结合结构域组合，其条件是聚合酶部分和DNA结合结构域是异源性的。例如，在其他实施方式中，融合蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的同一性可以为至少90％或95％或99％或100％，优选至少90％。在其他实施方式中，融合蛋白与SEQIDNO:3的序列同一性可以为至少90％或95％或98％或99％或100％，优选至少90％。链置换聚合酶可以具有或不具有3’-5’核酸外切酶活性。链置换聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性时，多核苷酸接合可以通过使用包括本文例示者的条件来平衡3’-5’核酸外切酶活性、5’-3’聚合活性和链置换活性加以优化。组装的效率和准确性可以使用本文所述的试验来确认(例如，参见图3A和3B)。在一些实施方式中，聚合酶不是Phusion、9°N、Pfu或Vent或者氨基酸序列与Phusion或野生型9°N、Pfu或Vent的同一性为至少90％的聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶是热稳定性的，即，在至少40℃或至少50℃的温度下有活性。与链置换聚合酶相反，一些聚合酶比如TaqDNA聚合酶经由5’→3’核酸外切酶活性降解遇到的下游链。该活性用于切口翻译方案。因此TaqDNA聚合酶不包括在链置换聚合酶的定义中。确定合成子形成的效率和准确性的试验描述于实施例中，并示于图3A～B。设计的组装片段编码lacl和lacZ蛋白质，如果DNA片段组装正确，其产生蓝色菌落。因此，过夜板“蓝色”菌落的数目指示组装的效率和准确性。在不存在蓝色的情况下，可能发生有效的组装，但接合/延伸区的错误阻止了表达。当合成子得以组装、并且然后克隆到宿主细胞中，合成子形成的效率和准确性转化成每个克隆将包含正确组装的合成子的置信度。借助该置信度，仅需要对一个或多个复制的克隆进行测序，以确认合成子的存在。这样降低了对可能包含错误的克隆进行测序的成本和不便。在一个实施方式中，至少80％或者另外可选地至少90％的克隆将会包含正确组装的合成子。在一些实施方式中，使用本文所述组合物的方法能够达到基本上超过最小需求的产率。例如，在单一转化事件中可以制备至多5,000或10,000个克隆。如果组装的目的不是制备合成子文库，而是制备单例合成子，则可以使用更低的核酸片段和试剂起始量，甚至其低于本文提供的范围。适合用于组装混合物的浓度范围的实例包括以下：0.02nM～100nM的DNA片段或者例如0.2nM～10nMDNA可以加入到反应容器中的试剂混合物中。在一个实施方式中，尽管可以使用更高或更低的比例，载体DNA与DNA片段以1:1的比例包括在内。与对于dsDNA所选择的浓度相比较，可以优选更高的ssDNA浓度。反应容器中的试剂混合物还可以包括0.0004U/μl～0.064U/μl的5’-3’核酸外切酶(例如0.0004U/μl～0.01U/μl)；0.5U/μl～32U/μl任选的连接酶(例如1U/μl～10U/μl)；0.0025U/μl～0.25U/μl链置换聚合酶(例如0.005U/μl～0.1U/μl)；和0.001μg/μl～0.1μg/μl的ss结合蛋白质(例如0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于组装合成子的组合物，其包括：(a)5’‑3’核酸外切酶；(b)链置换聚合酶；(c)任选地，单链DNA结合蛋白质；和(d)非天然存在的缓冲剂，其中所述组合物不包括拥挤剂和/或非链置换聚合酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.27 US 62/042,527;2015.07.07 US 62/189,599;1.一种用于组装合成子的组合物，其包括：(a)5’-3’核酸外切酶；(b)链置换聚合酶；(c)任选地，单链DNA结合蛋白质；和(d)非天然存在的缓冲剂，其中所述组合物不包括拥挤剂和/或非链置换聚合酶。2.根据权利要求1所述的组合物，其还包括连接酶和/或单链结合结构域。3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其还包括一组至少两种多核苷酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述链置换聚合酶为非天然存在。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述链置换聚合酶为突变体或融合蛋白。6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述链置换聚合酶对热稳定。7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述链置换聚合酶为B族聚合酶，并且所述组合物不包括非链置换聚合酶。8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中不包括9°N、Phusion、Vent或PfuDNA聚合酶。9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述链置换聚合酶为融合蛋白，其中聚合酶部分的氨基酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:102、或SEQIDNO:33至SEQIDNO:55中任意者的同一性为至少90％。10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的同一性为至少90％。11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述链置换聚合酶与SEQIDNO:3的序列同一性为至少90％。12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述单链DNA结合蛋白质为极端热稳定的单链DNA结合蛋白质(ETSSB)、大肠杆菌recA、T7基因2.5产物、噬菌体λRedB或Rac原噬菌体RecT。13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述5’-3’核酸外切酶具有单链核酸内切酶活性。14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述5’-3’核酸外切酶与SEQIDNO:98的序列同一性为至少90％。15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括浓度为至少7mM的钾盐。16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包括一组多核苷酸，其中所述组中的至少一种多核苷酸的序列与所述组中另一多核苷酸重叠；并且其中所述多核苷酸选自：(i)双链多核苷酸；(ii)单链寡核苷酸；(iii)至少一种双链多核苷酸和至少一种单链寡核苷酸；和(iv)除了在亚群成员之间变化的序列以外，否则彼此相同的多核苷酸亚群。17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸组的至少一种成员包含位于各末端处给定序列之间的用于与第二单链基因组多核苷酸杂交的随机序列。18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述随机序列为单链，并且其能够与用于将Cas蛋白质引导至用于基因编辑的靶标基因组核酸的靶标基因组序列杂交。19.一种用于形成合成子的方法，其包括：将根据权利要求1～15中任一项所述的组合物与具有能够在合适的反应条件下杂交的重叠序列的根据权利要求16～18中任一项所述的一组多核苷酸一起孵育；以及将至少一些所述多核苷酸与其他多核苷酸接合，以制备合成子。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组中所述多核苷酸的全部或部分为双链。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述双链多核苷酸为重叠PCR产物；重叠限制片段或者由互补单链寡核苷酸组装的合成双链分子。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述组中所述多核苷酸的全部或部分为单链寡核苷酸。23.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸组包括至少一种双链多核苷酸和至少一种单链寡核苷酸。24.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸组包括除了在亚群成员之间变化的序列以外，否则彼此相同的多核苷酸亚群。25.根据权利要求19～24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的重叠序列的长度小于2千碱基。26.根据权利要求19～25中任一项所述的方法，其中所述链置换聚合酶包括与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:33至SEQIDNO:96、或SEQIDNO:102中任意者的同一性为至少90％的氨基酸序列。27.根据权利要求19～26中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸组的至少一种成员包含在给定序列末端之间的随机序列。28.根据权利要求27所述的方法，其还包括筛选具有与基因组DNA杂交的活性的随机序列以及鉴定具有杂交活性的随机序列。29.根据权利要求27～28所述的方法，其还包括通过转录具有杂交活性的随机序列以形成RNA，以及在Cas蛋白质的存在下使用用于基因编辑的所述RNA，从而进行基因编辑。30.一种用于多核苷酸组装的试剂盒，其包括：(a)5’-3’核酸外切酶；(b)链置换聚合酶：和(c)任选地，单链D...

【专利技术属性】
技术研发人员：PC·赫塞，L·孙，T·C·小埃文斯，T·B·戴维斯，A·加德纳，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US