同时检测血清中五种类固醇激素的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11‑脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；检测方法包括如下步骤：样品前处理：在血清样品中加入内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，上清液吹干，加入复溶液，取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。上述检测方法采用一种方法同时检测血清中五种浓度范围不一致的化合物，同时检测五种化合物的时间约为8.5～12.0min。上述检测方法成本低，通量高灵敏度高、精密度高、特异性强。

【技术实现步骤摘要】
同时检测血清中五种类固醇激素的方法
本专利技术涉及分析检测
，特别是涉及一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法。
技术介绍
睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量，但绝经后妇女，卵巢分泌睾酮显著减少。睾酮分子量为288.42g/moL，结构式如下。大多数睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，少数与白蛋白结合，一小部分以游离形式存在，所有非SHBG结合的睾酮被认为是生物可利用的。在儿童期，过多睾酮会诱发男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，过量的睾酮会造成不同程度的男性化，包括多毛，痤疮，月经稀发，或不育。睾酮轻度至中度升高对男性通常无明显症状，但对女性造成严重的影响。对于睾酮轻度至中度升高的确切原因往往不清楚。明显升高的常见原因包括遗传疾病(如先天性肾上腺皮质增生症)，肾上腺，睾丸和卵巢的肿瘤和运动员滥用睾丸激素或促性腺激素等。女性的睾酮降低会引起微妙的症状。这主要包括性欲下降和非特异性的情绪变化。在男性，它会导致性腺功能减退。这个特点将改变男性的第二性征和生育功能。雄烯二酮主要通过肾上腺分泌，其产量一定程度上由促肾上腺皮质激素(ACTH)调节，此外还由睾丸和卵巢通过将脱氢表雄酮硫酸盐(DHEA-S)转化而来。雄烯二酮分子量为286.41g/moL，结构式如下。雄烯二酮为一种重要的性类固醇激素前提物。它主要通过两种生物合成途径生成：来自孕酮或脱氢表雄酮(DHEA)等衍生生成。过高的雄烯二酮水平可能会引起女性雄激素过多症的症状。男性通常无症状，但是通过外围的雄性激素转化为雌激素可能偶然使其经历雌激素过多的轻度症状，例如男性女性型乳房。大多数温和的雄烯二酮水平增高是正常的，但是，显著的增高可能表明肾上腺和性腺肿瘤。雄烯二酮主要用于评估肾上腺，卵巢或睾丸功能，如激素的产生影响男性生殖器官和生理特征(雄性激素)。结合实验室其他检测项目，最通常用于诊断引起高水平睾酮激素女性过量雄性激素症状的原因。11-脱氧皮质醇(化合物S)是胆固醇转化为皮质醇的中间产物，皮质醇分子量为346.46g/moL，结构式如下。11-脱氧皮质醇主要用于诊断11-beta-羟化酶缺乏症和原发性(肾上腺衰竭)或者继发性(肾上腺轴ACTH缺乏)肾上腺机能不足。可的松分子量为360.44g/moL，结构式如下。当患者患有库欣综合征时，皮质醇和可的松水平同时增高，当服用外源性糖皮质激素药物如强的松时，皮质醇和可的松水平会下降。对于显著的盐皮质激素过剩患者(AME)可的松的形成减少，并使皮质醇行使盐皮质激素功能。因此一般显著的盐皮质激素过剩患者(AME)常伴随着可的松和醛固酮水平较低，而皮质醇水平正常。由于甘草汁可抑制皮质醇转化为可的松，因此会减少可的松的血液循环水平。皮质醇是由肾上腺产生的一种激素。位于颅底蝶鞍的垂体生成ACTH(促肾上腺皮质激素)，后者刺激肾上腺合成分泌皮质醇。皮质醇分子量为362.46g/moL，结构式如下。皮质醇在机体中扮演大量角色：皮质醇参与蛋白质、糖和脂质分解，维持血压，调节免疫系统。冷热、感染、创伤、精神、运动、肥胖和糖尿病可以影响皮质醇浓度。皮质醇的分泌具有时间周期性，早晨分泌增多，在早晨8点达到高峰；傍晚则降低。这种模式可被称为：“昼夜变异”或“昼夜节律”，如果人体工作时间不固定(例如夜班)以及每天睡眠时间不固定时，上述节律会发生改变。皮质醇不足可引发非特异性症状：体重减轻、肌肉无力、疲劳、血压过低和腹痛。有时皮质醇降低合并压力有可能导致肾上腺危象，后者需要立即就医。皮质醇含量过高会导致高血压、血糖过高、肥胖、皮肤脆弱、腹部紫纹、肌肉无力和骨质疏松。目前国内普遍采用免疫法分别检测不同的类固醇激素：如睾酮、4-雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、可的松和氢化可的松等，但是免疫法普遍存在交叉反应性强，特异性差，灵敏度低，准确度低等问题，而LC-MS/MS法是目前被广泛接受的小分子定量检测的金标准方法，它的优势在于灵敏度高，检测限低，选择性好及准确度和特异性高，它能够区别结构相似的化合物。但是由于人体内这五种激素的浓度范围宽，部分浓度高，部分浓度低尤其是女性及儿童的睾酮浓度，且这些类固醇激素主要以蛋白结合的形式存在，且人体血液组成复杂存在大量的高亲和力结合蛋白，因此采样质谱法检测但仍然需要解决以下问题：1)严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低；2)提高检测效率，用同一种方法同时检测这五种类固醇激素；3)不同化合物浓度相差较大或者同一化合物不同人群浓度相差大，要求线性范围宽。为了降低基质干扰，提高特异性、灵敏度等，目前常采用方法有：方法一：离线-样本先经蛋白沉淀，再经过液液萃取或者液固萃取后进行氮吹浓缩得到待测样本，样本经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测；方法二：在线-样本先经蛋白沉淀后经过在线萃取装置得到待测物，再经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测。但是这两种方法存在如下的问题：方法一前处理复杂、处理时间长(一个样本约2小时)、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高；方法二仪器投入大，且在线萃取的耗材成本高。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法。具体的技术方案如下：一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，包括如下步骤：所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；样品前处理：在血清样品中加入含有睾酮内标物、雄烯二酮内标物、11-脱氧皮质醇内标物、皮质醇内标物和可的松内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，震荡，离心取上清液于氮吹仪中，吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；其中，富集柱为C6柱，分析柱为C18柱；流动相1：A相为去离子水，B相为甲醇，流速为1.0-2.0ml/min；流动相2：C相为15mM/L醋酸铵水溶液，D相为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速为0.2-1.0ml/min。在其中一些实施例中，流动相采用梯度洗脱模式：0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为90:10，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.15min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱；3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为55:45；4.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为35:65；5.0min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为25:75；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；5.5min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；8.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为90:10；整个梯度时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11‑脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；样品前处理：在血清样品中加入含有睾酮内标物、雄烯二酮内标物、11‑脱氧皮质醇内标物、皮质醇内标物和可的松内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，震荡，离心取上清液于氮吹仪中，吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；样品前处理：在血清样品中加入含有睾酮内标物、雄烯二酮内标物、11-脱氧皮质醇内标物、皮质醇内标物和可的松内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，震荡，离心取上清液于氮吹仪中，吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。2.根据权利要求1所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；其中，富集柱为C6柱，分析柱为C18柱；流动相1：A相为去离子水，B相为甲醇，流速为1.0-2.0ml/min；流动相2：C相为15mM/L醋酸铵水溶液，D相为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速为0.2-1.0ml/min。3.根据权利要求2所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，流动相采用梯度洗脱模式：0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为90:10，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.15min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱；3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为55:45；4.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为35:65；5.0min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为25:75；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；5.5min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；8.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为90:10；整个梯度时间为8.5～12.0min。4.权利要求3所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述流动相1的流速为1.0-1.2ml/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6ml/min。5.权利要求1-4任一项所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述睾酮内标物为睾酮的C13标记物或氘代标记物，所述雄烯二酮内标物为雄烯二酮的C13标记物或氘代标记物，所述11-脱氧皮质醇内标物为11-脱氧皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述皮质醇内标物为皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述可的松内标物为可的松的C13标记物或氘代标记物。6.权利要求5所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；所述正离子模式中，目标定量离子对包括：睾酮离子对、雄烯二酮离子对、11-脱氧皮质醇离子对、皮质醇离子对和可的松定量离子对；和/或，睾酮内标物的定量离子对、雄烯二酮内标物的定量离子对、11-脱氧皮质醇内标物的定量离子对、皮质醇内标物的定量离子对和可的松内标物的定量离子对；目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：睾酮的母离子的质/荷比为28...

【专利技术属性】
技术研发人员：何翠红，李玉冬，梁田，苗季，赖坤元，熊晓明，
申请(专利权)人：博厚健康科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44