茶叶悬浮单细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，包括茶树叶片的选取、无菌叶片的消毒、愈伤组织的诱导、液体悬浮细胞的培养、液体悬浮细胞的扩大培养、单细胞分离等步骤。本发明专利技术方法所制备的茶叶悬浮细胞生长速度快，代谢活性较高。建立了一个快速生长的悬浮细胞培养体系及单细胞分离方法，为茶叶细胞学研究和次级代谢产物的研究奠定基础。对后续茶树次生代谢产物的生产、代谢物细胞定位及代谢机理研究及外源化合物胁迫条件下茶树细胞代谢物变化及机制研究提供了很好的技术平台。

Method for separating and culturing tea suspension single cell

The invention discloses a separating tea suspended single cell culture method, including the selection of tea leaves, leaves of aseptic sterilization, callus induction, suspension cell culture, cell suspension culture, liquid expansion of single cell separation steps. The tea suspension cell produced by the method of the invention has fast growth rate and high metabolic activity. A rapid growth suspension cell culture system and a single cell separation method were established to lay the foundation for cytological studies and secondary metabolites of tea. The study will provide a good platform for the study of the secondary metabolites production, metabolites, cell localization and metabolic mechanism of tea leaves, and the changes of the metabolites and mechanisms of tea tree cells under the stress of exogenous compounds.

【技术实现步骤摘要】
茶叶悬浮单细胞的分离培养方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及通过植物组织培养的方法，获得茶树叶片的愈伤组织后，对愈伤组织进行单细胞分离获得茶叶悬浮单细胞的方法。
技术介绍
茶树，拉丁文名：Camelliasinensis(L.)O.Ktze，山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。茶树的叶子可制茶(有别于油茶树)，种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。我国是茶叶传统出口大国，据相关数据显示，当前全球各个产茶国家中，我国的茶叶年产量居于第一位，出口总量居于第二位，仅仅低于肯尼亚。茶叶中含有对人体有益的茶多酚、氨基酸、咖啡碱等物质，具有提神醒脑、解毒利尿、“三抗三降”等功效，是世界三大无酒精饮料之一。茶树其高度的自交不亲和性、自交衰退、结实率低等限制了遗传改良工作的进行；另外细胞学平台的缺乏也阻碍了茶叶中主要内含健康功能成分的代谢机理的研究。利用茶树组织培养技术及单细胞培养技术，可以加快茶树育种、缩短育种周期，并可利用组织培养进行茶树次生代谢产物可以开展细胞学和遗传转化研究，包括：次生代谢产物的生产、代谢物细胞定位及代谢机理研究、并为外源化合物胁迫条件下茶树细胞代谢物变化及机制研究提供了很好的技术平台。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过植物组织培养技术，建立一个快速生长的茶叶细胞悬浮培养体系并且分离出茶叶单细胞，维持其可持续开发和利用，也为茶叶细胞学和次级代谢机理的研究与遗传转化研究奠定基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的：茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，通过外植体组织培养，获得愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养后经分离获得茶叶悬浮单细胞。进一步，所述外植体为茶树新稍上部幼嫩叶片。进一步，对外植体进行进行愈伤组织培养的培养基为：MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+蔗糖30g/L，+琼脂6.5-7.0g/L，pH5.8。进一步，悬浮培养的培养基为B5+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+蔗糖20g/L。进一步，悬浮培养的培养基为B5+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+蔗糖20g/L。进一步，愈伤组织经25℃恒温摇床中，避光悬浮培养5-10天后，将悬浮细胞转入新配制的悬浮培养基中再继代培养培养21-28天；制备悬浮初代细胞时添加果胶酶，再经2-3次悬浮继代培养后，得到茶叶悬浮单细胞。进一步，所述果胶酶需经过0.22um无菌滤膜处理，所述果胶酶添加量为悬浮培养基体积的3％-5％。进一步，所述愈伤组织培养后还包括继代培养，所述继代培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+蔗糖30g/L+琼脂6.5-7.0g/L，pH5.8。进一步，所述外植体包括预处理，具体是指将采摘后幼嫩叶片流水冲洗1h，质量分数50％多菌灵溶液冲洗浸泡4h，2.0g/L的PVPP溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，然后将漂洗干净的叶片用质量分数75％乙醇消毒10秒，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌吸水纸吸干叶表水。与已有技术相比，本专利技术优点体现在：首先，本专利技术通过植物组织培养技术，将生长旺盛的茶树外植体诱导出愈伤组织后，对其愈伤组织接种于特定激素和培养基的组合进行扩大再培养、在特定激素和培养基的悬浮体系中通过不断继代和振荡，将团簇愈伤组织不断分离，最终获得单细胞；同时，对初代悬浮培养的愈伤组织进行不断的扩大再培养，即可获得大量、充足的悬浮茶树单细胞；并且在悬浮培养过程中添加适量果胶酶，促进细胞的分离；其次，对不同季节采摘的外植体诱导愈伤组织的激素略有不同，以及悬浮培养严格控制每瓶的装液量(150ml锥形瓶装液40ml)，使悬浮细胞保持最适生长活力。其技术难点在于①秋冬季茶树愈伤诱导率较春夏季较低，因此采用不同激素诱导；②根据愈伤的生长变化情况及时更换新鲜培养基以及激素配比的调整；本专利技术方法与现有技术不同的两点在于，对于不同季节采摘的外植体采用不同激素配比；悬浮培养过程中添加果胶酶促进细胞分离；在适宜环境下，对初次悬浮愈伤的不断培养和继代，即可不断获得茶树单细胞。附图说明图1是不同激素组合的愈伤组织诱导培养基的诱导结果。图中(A)、(B)、(C)分别对应表3中组别1、2、3不同激素组合的愈伤组织。图2.为不同KT激素浓度下组织继代培养的结果。图中，(A)、(B)、(C)分别为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/LKT浓度下愈伤组织继代培养结果。图3为愈伤组织生长状况随继代次数的增加而变化结果。图中(A)、(B)、(C)、(D)分别为继代培养2-5次的结果。图4.为液体悬浮细胞培养过程，图中a.为固体愈伤经过无菌刀片切碎后；b.为经过5-10天，上清悬浮添加新配置B5培养基；c.为经过一次继代后悬浮细胞生长状况；d.为经过2-3次继代后悬浮细胞生长到旺盛时期。图5.为茶叶悬浮细胞经过2-3次继代分离后，400倍显微镜下状况。图6为秋冬季采摘外植体在添加2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+0.5mg/L6-BA初代诱导培养基培养后，再经继代培养基培养基培养28d后生长状况，图6中，(a)为初代诱导结果，(b)为继代一次结果。具体实施方式下面结合实例对本专利技术作进一步详述。实施例中所述的培养方法均在干净的工作台进行，MS和B5培养基为自行配置的母液(配方表参见表1，表2)，冷藏保存，实施例中所述的室温为20～25℃。表1.MS培养基母液配置表表2.B5液体培养基母液配置及取用量(单位：mg/L)实施例(1)固体愈伤组织诱导培养基和固体愈伤组织继代培养基的配制：以配置1L培养基为例，将先配置好的MS培养基母液按照比例称取，放于5L烧杯中，按2.0mg/L的比例添加2,4-D，0.5mg/L的比例添加KT，30g/L的比例添加蔗糖，7g/L的比例添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5L烧杯中至刻度1L，并搅拌均匀后，用1mol/L氢氧化钠调整pH至5.8，然后分装在组培瓶中，121℃高压灭菌15min后，充分冷却凝固，备用，得到固体愈伤组织诱导培养基。以配置1L培养基为例，将先配置好的MS培养基母液按照比例称取，放于5L烧杯中，按1.0mg/L的比例添加2,4-D，0.1mg/L的比例添加KT，30g/L的比例添加蔗糖，7g/L的比例添加琼脂，加入至煮沸纯水中搅拌均匀后，倒入5L烧杯中至刻度1L，并搅拌均匀后，用1mol/L氢氧化钠调整pH至5.8，然后分装在组培瓶中，121℃高压灭菌15min后，充分冷却凝固，备用，得到固体愈伤组织继代培养基。(2)液体悬浮培养基的配制以配置1L培养基为例，将先配置好的B5培养基母液按照比例称取，至5L烧杯中，按1.0mg/L的量添加2,4-D，0.1mg/L的量添加KT，20g/L的量添加蔗糖，然后加入纯水至1L体积，分装与150mL锥形瓶40mL，封口，121℃高压灭菌15min后，冷却备用，得到液体培养基。(2)茶叶悬浮单细胞的分离培养方法以茶树品种“龙井43”为例，春季龙井43新稍上部幼嫩叶片，采摘后流水冲洗1h，配制质量分数50％多菌灵溶液冲洗浸泡4h，2.0g/L的PVPP溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，将漂洗干净的叶片作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，通过外植体组织培养，获得愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养后经分离获得茶叶悬浮单细胞。

【技术特征摘要】
1.茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，通过外植体组织培养，获得愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养后经分离获得茶叶悬浮单细胞。2.根据权利要求1所述的茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，所述外植体为茶树新稍上部幼嫩叶片。3.根据权利要求1所述的茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，对外植体进行进行愈伤组织培养的培养基为：MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+蔗糖30g/L，+琼脂6.5-7.0g/L，pH5.8。4.根据权利要求1所述的茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，悬浮培养的培养基为B5+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+蔗糖20g/L。5.根据权利要求4所述的茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，愈伤组织经25℃恒温摇床中，添加果胶酶后避光悬浮培养5-10天，将悬浮细胞转入新配制的悬浮培养基中再继代培养培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯如燕，胡奕铮，焦卫婷，孙俊，李建超，肖昱，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34