用于测量维生素D的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于测量25‑羟基维生素D的体外方法，其中潜在干扰化合物24,25‑二羟基维生素D3被特异性地结合24,25‑二羟基维生素D3且不结合25‑羟基维生素D的结合剂阻断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量维生素D的方法背景信息本专利技术涉及一种用于测量25-羟基维生素D的体外方法，其中潜在干扰化合物24,25-二羟基维生素D3被特异性地结合24,25-二羟基维生素D3且不结合25-羟基维生素D的结合剂阻断。如术语“维生素(vitamin)”已经暗示的，维生素D的充分供给是极其重要的。维生素D的缺乏会导致严重的疾病诸如佝偻病或骨质疏松症。尽管在上个世纪的早期维生素D仍然被视作单一物质，但是在过去的几十年中维生素D系统已经变为维生素D代谢产物的复杂且多样的网络。现在，已知超过40种不同的维生素D代谢产物(Zerwekh,J.E.,Ann.Clin.Biochem.41(2004)272-281)。人类只可以通过来自阳光的紫外线在皮肤上的作用而产生D3维生素或麦角钙化醇。在血液中，维生素D3结合所谓的维生素D-结合蛋白并将被运输至肝脏，在此处它通过25-羟基化转化成25-羟基维生素D3。目前已知除皮肤和肝脏（已经提及的两个器官）之外的许多其它组织涉及维生素D代谢(Schmidt-Gayk,H.等人(编),“Calciumregulatinghormones,vitaminDmetabolitesandcyclicAMP”,SpringerVerlag,Heidelberg(1990)第24-47页)。25-羟基维生素D，更具体地25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3、就其数量而言，是维生素D在人生物体中的重要贮存形式。当需要时，这些前体可以在肾中转化以形成生物活性的1α,25-二羟基维生素D，即所谓的D激素。生物活性的维生素D尤其调节从肠的钙摄取、骨矿化，并且它影响大量其它代谢途径例如胰岛素系统。当确定受试者或患者的维生素D状况时，测量维生素D水平本身是没有多少益处的，因为维生素D(维生素D2和维生素D3)的浓度随食物摄取或者向阳光的暴露有很大波动。另外，维生素D在循环中具有相对短的生物半衰期(24小时)，因此由于该原因它也不是适用于确定患者的维生素D状况的合适参数。同样也适用于维生素D的生理学活性形式(1,25-二羟基维生素D)。相对于25-羟基维生素D而言，这些生物活性形式也以相对小的且较大波动的浓度存在。由于所有这些原因，25-羟基维生素D的量化特别是全面分析受试者或患者的总维生素D状况的合适方式。维生素D代谢产物如25-羟基维生素D被维生素D-结合蛋白以高亲和力结合，且也在有限的程度上与白蛋白和一些脂蛋白结合。相比于从任何其它蛋白释放维生素D代谢产物而言，适于从维生素D-结合蛋白释放维生素D代谢产物的方法将在正常情况下也是非常适合的。25-羟基维生素D或其它维生素D化合物与维生素D-结合蛋白的结合使得维生素D化合物的确定极大地复杂化。所有已知的方法要求，待分析的维生素D化合物从它与维生素D-结合蛋白形成的复合物释放或脱离。在下文中，为了简化的目的，这被称为维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，尽管当然它只可以从维生素D化合物和维生素D-结合蛋白的复合物释放，而不会从单独的维生素D-结合蛋白释放。维生素D-结合蛋白在酸性pH下是未折叠的，但是当pH变回中性条件时具有正确地重折叠且重新结合分析物的高趋势。因此，经常需要首先从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，然后将维生素D-结合蛋白与待分析的维生素D化合物分离。由于25-羟基维生素D的高临床重要性，从文献中已知大量允许大致上可靠地确定25-羟基维生素D的方法。例如Haddad,J.G.等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.33(1971)992-995和Eisman,J.A.等人,Anal.Biochem.80(1977)298-305描述了使用高效液相色谱法(HPLC)确定血液样品中的25-羟基维生素D浓度。用于确定25-羟基维生素D的其它方案尤其是基于维生素D-结合蛋白（如存在于乳中的那些）的应用。因此，Holick,M.F.和Ray,R.(US5,981,779)和DeLuca等人(EP0583945)描述了关于羟基维生素D和二羟基维生素D的维生素D测定，其基于这些物质与维生素D-结合蛋白的结合，其中借助于竞争性测试程序来确定这些物质的浓度。但是，该方法的先决条件是，待确定的维生素D代谢产物首先必须从原始血液或血清样品分离，并且必须通过例如色谱法进行纯化。Armbruster,F.P.等人(WO99/67211)教导，应当通过乙醇沉淀法制备用于维生素D确定的血清或血浆样品。在该方法中，通过离心除去蛋白沉淀物，并且乙醇上清液含有可溶性的维生素D代谢产物。这些可以在竞争性结合测定中测量。可选地，EP0753743教导，使用高碘酸盐，可以从血液或血清样品分离蛋白。在该情况下，在来自用高碘酸盐处理过的样品的不含蛋白的上清液中确定维生素D化合物。在一些商业测试中，乙腈被推荐用于萃取血清或血浆样品(例如，在来自DiaSorin的放射免疫测定中或在“Immundiagnostik”公司的维生素D测试中)。在近年，提出了许多不同的释放试剂，其原则上应当适合用于从存在于样品中的任何结合蛋白释放维生素D化合物。但是，这种释放或脱离应当在相对温和条件下进行，因而能够在结合测试中直接使用经释放试剂处理过的样品(参见例如WO02/57797和US2004/0132104)。尽管在近年中有很多努力，但是用于确定维生素D的所有可利用的方法具有缺点，诸如费力的样品制备、差的标准化、测试程序之间的不良一致性或峰值(spiked)维生素D的差回收(就此特别参见Zerwekh,J.E.,出处同上)。在US7,087,395中，金属氢氧化物以及环糊精及其衍生物和金属水杨酸盐已经用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，这会导致维生素D-结合蛋白或其它血清蛋白的不可逆变性。表面活性剂如TritonX100或吐温-20已经用于在变性后防止维生素D化合物非特异性地结合样品中的脂质和蛋白。特别难以使维生素D化合物的测试自动化。自动化要求解决一个非常困难的问题，即钢丝行走存活（survivingatightropewalk）：一方面，需要借助于合适的释放试剂从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，另一方面，必须选择条件使得所述样品可以直接进一步分析。该直接进一步分析的先决条件是，一方面，内源性维生素D-结合蛋白在该分析期间不会结合或不再显著地结合维生素D化合物，并因此不会干扰该分析，和另一方面，所用的释放试剂不会干扰检测试剂诸如抗体或维生素D-结合蛋白的结合。另外，已知的是，维生素D-结合蛋白的不同等位基因存在于具有不同生物化学表现的人群中。维生素D化合物的释放和测量应当是与各种等位基因/表型可比较的。最近(WO2011/144661)，使用适当样品处理的维生素D测定可以在线执行，且无需沉淀/分离可能存在于样品中的任何维生素D-结合蛋白。该方法是基于维生素D释放试剂的应用，所述维生素D释放试剂含有碳酸氢盐和/或在水解后能够释放碳酸氢根离子(HCO3-)的物质（0.1M至2.0M的总浓度）、还原剂和碱化剂。通过使用该释放试剂，任何维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，同时，在样品中包含的维生素D-结合蛋白被灭活且不再结合维生素D。可以通过适当方式测量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于没有24,25‑二羟基维生素D3干扰地确定25‑羟基维生素D的浓度的体外方法，所述方法包括下述步骤：a)提供得自受试者的样品，其包含与维生素D‑结合蛋白结合的维生素D化合物，b)将所述样品与以下结合剂混合(ba)结合24,25‑二羟基维生素D3的第一结合剂，由此形成所述第一结合剂和24,25‑二羟基维生素D3之间的复合物；(bb)结合25‑羟基维生素D的第二结合剂，由此形成所述第二结合剂和25‑羟基维生素D之间的复合物；c)测量在(bb)中形成的复合物，由此没有24,25‑二羟基维生素D3干扰地确定25‑羟基维生素D的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.08 EP 14196778.61.一种用于没有24,25-二羟基维生素D3干扰地确定25-羟基维生素D的浓度的体外方法，所述方法包括下述步骤：a)提供得自受试者的样品，其包含与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物，b)将所述样品与以下结合剂混合(ba)结合24,25-二羟基维生素D3的第一结合剂，由此形成所述第一结合剂和24,25-二羟基维生素D3之间的复合物；(bb)结合25-羟基维生素D的第二结合剂，由此形成所述第二结合剂和25-羟基维生素D之间的复合物；c)测量在(bb)中形成的复合物，由此没有24,25-二羟基维生素D3干扰地确定25-羟基维生素D的浓度。2.根据权利要求1的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。3.根据权利要求1和2中的任一项的方法，其中在步骤(b)之前用释放试剂从维生素D-结合蛋白释放与维生素D-结合蛋白结合的存在于样品中的维生素D化合物。4.根据权利要求1-3中的任一项的方法，其中-Kd(第一结合剂)/Kd(第二结合剂)是10或更小；和/或-浓度(第一结合剂)/浓度(第二结合剂)是至多200；其中Kd(第一结合剂)是所述第一结合剂对24,25-二羟基维生素D3的亲和力，且Kd(第二结合剂)是所述第二结合剂对25-羟基维生素D的亲和力，和其中浓度(第一结合剂)和浓度(第二结合剂)分别是步骤b)中的第一结合剂和第二结合剂的摩尔浓度，特别地其中浓度(第一结合剂)是在1*(1-10)nmol/L至200*(1-10)nmol/L的范围内，和/或浓度(第二结合剂)是在1-10nmol/L的范围内。5.根据权利要求1-4中的任一项的方法，其中-所述第一结合剂关于结合24,25-二羟基维生素D3的Kd是10-8mol/L或更小；和/或-所述第二结合剂关于结合25-羟基维生...

【专利技术属性】
技术研发人员：E法茨，M盖格，HP约泽尔，C福格尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH