一种APMV‑4型病毒的检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种APMV‑4型病毒的检测方法，该方法通过以下步骤实现：首先取200 μL的病毒尿囊液，进行样品RNA的提取，然后用25 μL DEPC水来溶解RNA，得待测产品；将上述待测产品进行一步法RT‑PCR反应；对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检验。本发明专利技术所建立的一步法的RT‑PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV‑4样品的检测，非常适合基层实验室的应用；本发明专利技术特异性的针对APMV‑4型病毒，可区分检测APMV‑1型和 APMV‑4型的病毒，特异性强，灵敏度高。

A detection method of APMV virus type 4

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular relates to a method for detection of APMV virus type 4, the method is realized by the following steps: firstly, virus allantoic fluid from 200 mu L, extracted RNA samples, and then dissolved with 25 RNA L DEPC water, the product will be tested on; the products to be tested by one-step RT PCR reaction; the results of DNA amplification and agarose gel electrophoresis test. RT PCR technology one step set up by the invention has the advantages of rapid, accurate and sensitive, and can be used for APMV was detected in 4 samples, is very suitable for the primary laboratory; the specificity for APMV virus type 4, can distinguish between type 1 and APMV detection APMV type 4 virus strong specificity and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种APMV-4型病毒的检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种APMV-4型病毒的检测方法。
技术介绍
禽副黏病毒(APMVs)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属（禽流感病毒除外），常常能从世界各地的家禽及野生鸟类中分离得到。目前，腮腺炎病毒属的APMVs分为9个血清型(APMV1~9)。新城疫病毒是禽副黏病毒1型的代表，也是各禽副黏病毒类型中特点和研究最为透彻的。而对禽副黏病毒2~9(APMV2~9)的分子特性和致病性知之甚少，对于APMV-4的研究现在已获悉APMV-4只能从水禽中分离到，可导致病禽的肺炎、支气管炎等呼吸道症状。APMV-4的基因组全长是15054个核苷酸，并与副黏病毒“六规则”一致。基因组包含6个非重叠的基因，囊膜蛋白为NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）和L（RNA依赖性聚合酶）；外部蛋白为M膜蛋白、F（融合蛋白）和HN（血凝素-神经氨酸酶蛋白）。目前针对APMV-4型病毒的相关研究非常少，关于本病的诊断研究则更少。文献《禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立》提供了一种荧光RT-PCR检测方法，该方法成本高，需要昂贵的仪器设备，不适合普通基层实验室进行应用。中国专利CN101892321A公开了一种检测禽副黏病毒1型的方法，该方法仅仅是针对禽副黏病毒1型的NP蛋白的高度保守区设计了引物。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种APMV-4型病毒的检测方法。本专利技术所采用的具体技术方案为：本专利技术提供了一种APMV-4型病毒的检测方法，该方法所采用的引物为：APMV4-F：5'-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3'；APMV4-R：5'-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3'。进一步的，所述检测方法具体包括以下步骤：（1）取200μL的病毒尿囊液，进行样品RNA的提取，然后用25μLDEPC水来溶解RNA，得待测产品；（2）将上述待测产品进行一步法RT-PCR反应；（3）对DNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检验。进一步的，所述RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步PCR扩增94℃20S、52℃20S、72℃30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。本专利技术的有益效果为：本专利技术建立了可用于检测APMV-4的一步法RT-PCR方法，该方法能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库，即cDNA合成与PCR反应在同一Buffe及酶中进行，减少了反应时间。特异性试验表明本方法特异性强，与新城疫病毒(NDV)无交叉反应。灵敏度高，本专利技术的检测最小量可为102EID50。因此，本专利技术所建立的一步法的RT-PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV-4样品的检测，非常适合基层实验室的应用；本专利技术特异性的针对APMV-4型病毒，可区分检测APMV-1型和APMV-4型的病毒。附图说明图1为一步法RT-PCR检测结果M.MarkerDL20001-3.APMV-4的扩增结果4.NDV的扩增结果。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进一步详细说明。实施例11、参照GenBank中APMV-4的F基因序列，设计一对引物（APMV4-F、APMV4-R），用于扩增F基因部分片段。引物由华大基因公司合成，PAGEplus级纯化。APMV4-F：5'-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3'APMV4-R：5'-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3'，预计扩增798bp。2、RT-PCR2.1RNA提取选取鸭APMV-4分离毒株QY17进行检测。病毒RNA的提取按照博日生物SimpleRNAkit操作进行，最后用25μLDEPC水来溶解RNA。2.2一步法RT-PCRRT-PCR按照TaKaRa公司的一步法RT-PCR的操作说明进行：2×PCRBuffer（含dNTP）25μL、混合酶（RTase、HStaq、RNaseinhibitor）2μL、RNA模板10μL、RNase-freeH2O补充至50μL。RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步PCR扩增94℃20S、52℃20S、72℃30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µL反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。RT-PCR扩增：APMV-4分离毒株PCR扩增得到预期大小的扩增片段，约0.8kb。对照组NDV（即APMV-1病毒）在此处未出现扩增条带。(见图1)敏感性试验:将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行RT-PCR操作。扩增结果显示本方法的检测最小量可为102EID50，说明建立的检测方法灵敏性较好。对比例11.1采用引物（CN101892321A提供的引物）进行检测，1.2.RNA提取选取鸭APMV-4分离毒株QY17和APMV-1病毒进行检测。病毒RNA的提取按照博日生物SimpleRNAkit操作进行，最后用25μLDEPC水来溶解RNA；1.3一步法RT-PCRRT-PCR按照TaKaRa公司的一步法RT-PCR的操作说明进行：2×PCRBuffer（含dNTP）25μL、混合酶（RTase、HStaq、RNaseinhibitor）2μL、RNA模板10μL、RNase-freeH2O补充至50μL。RT-PCR反应条件：反转录反应第一步42min20℃，第二步94℃3min，第三步PCR扩增94℃20S、52℃20S、72℃30S进行33个循环，第四步72℃延伸4min。取5µL反应产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳（5V/cm）电泳30min，凝胶成像系统观察结果。APMV-4分离毒株QY17和APMV-1病毒都得到了387bp的片段。结论：无法区分APMV-4及APMV-1病毒。临床应用选取14份动物攻毒试验后的组织样品进行上述One-stepRT-PCR方法的检测。结果检测出了11株阳性样品，经序列比对证实为APMV-4病毒。以上检测结果与鸡胚接种分离病毒的检测结果一致，由此说明本方法的特异性高，而且检测周期只需几小时，而鸡胚接种检测则需数天完成。核苷酸序列表<110>山东省农业科学院家禽研究所<120>一种APMV-4型病毒的检测方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><223><400>1TCACAAGGACTCGAGGCAAC20<210>2<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><223><400>2TCAATTTCGAGGTCGGCACA20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种APMV‑4型病毒的检测方法，其特征在于，该方法所采用的引物为：APMV4‑F：如SEQ ID NO：1所示；APMV4‑R：如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种APMV-4型病毒的检测方法，其特征在于，该方法所采用的引物为：APMV4-F：如SEQIDNO：1所示；APMV4-R：如SEQIDNO：2所示。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取200μL的病毒尿囊液，进行样品RNA的提取，然后用25μLDEPC水来溶解RNA，得待测产品；...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁小远，王友令，杨金兴，张玉霞，于可响，宋敏训，亓丽红，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37