双gRNA、双gRNA文库、双gRNA载体文库及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双gRNA、双gRNA文库、双gRNA载体文库及其制备方法和应用。该双gRNA由第一启动子、gRNA‑a、crRNA支架序列、第二启动子和gRNA‑b顺次连接而成。该双gRNA文库包括针对靶基因的多个双gRNA。该双gRNA载体文库即由该双gRNA文库与载体连接而成。本发明专利技术的双gRNA中，gRNA‑a和gRNA‑b分别由不同的启动子控制其独立表达，并分别与靶基因上的两个靶位点互补配对，这使得该双gRNA能够招募Cas9核酸酶在两个sgRNA作用位点对靶基因进行剪切，有效提高靶基因的敲除效率。

Double gRNA, double gRNA library, double gRNA vector library, preparation method and application thereof

The invention discloses a double gRNA, double gRNA library, a double gRNA vector library, a preparation method and an application thereof. The double gRNA promoter and gRNA by the first a, crRNA stent sequence, second promoter and gRNA B which are connected into. The dual gRNA library includes multiple double gRNA targeting the target gene. The dual gRNA vector library is formed by connecting the two gRNA libraries with a vector. Double gRNA of the invention, gRNA A and gRNA B respectively by different promoter to control the expression of independent and complementary, respectively and two target sites of target genes on the pairing, which makes the double gRNA can recruit Cas9 nuclease cut the target gene in two sgRNA binding sites, effectively improve the target gene knockdown efficiency.

【技术实现步骤摘要】
双gRNA、双gRNA文库、双gRNA载体文库及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种双gRNA、双gRNA文库、双gRNA载体文库及其制备方法和应用。
技术介绍
众所周知，蛋白质编码基因的转录只占全基因组转录的大约2％，其余的转录则均为非编码RNA如microRNA和lncRNA的转录。其中，lncRNA被定义为一组分子量大于200个核苷酸长度的非编码RNAs，越来越多的研究表明，LncRNA可能在各种机制中作为主要基因调控者，lncRNA表达的紊乱通常与多种人类疾病，如癌症，密切相关。到目前为止，已经有超过50,000的lncRNA被发现，这比蛋白质编码基因的数量要多得多，这也为我们人类基因组的复杂性提供了进一步证据。lncRNA是新型癌症生物标志物或治疗靶点的丰富来源，而且绝大部分lncRNA的生物学功能还是未知，对lncRNA进行功能性研究非常重要。目前最常用的基因功能性研究平台是通过RNA干扰(RNAi)对细胞中的目标基因进行敲除，特异性剔除或关闭特定基因的表达，然后检测干扰结果，通过分析该干扰结果了解相关基因的功能。遗憾的是，RNAi主要在细胞质中发挥功能性作用，而RISC复合物也位于细胞质中。然而许多lncRNA都位于细胞核中，这大大增加了通过RNA干扰敲除lncRNA的难度。同时，RNAi存在以下不足：(1)很难进行“回复实验”，因为外源性的配对物也受到RNAi试剂的约束；(2)敲除效率不高，极易出现高水平的假阴性表达，尤其在shRNA载体中。因此寻找新的基因功能性研究方法具有十分重大的意义。CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，在这一系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(singleguideRNA，简称sgRNA)表达，sgRNA同样可以起到靶向剪切的作用。sgRNA的序列中含有一段固定序列(即crRNA支架序列)和一段目的DNA识别序列，其中目的DNA识别序列可与目的基因两条链中的其中一条进行碱基互补配对，而固定序列则用于招募Cas9核酸酶。鉴于CRISPR/Cas9系统的高效性，针对蛋白质编码基因的敲除是比较容易的，因为一个微小的碱基缺失或插入就可以破坏开放阅读框，从而导致功能性基因产物的不表达。然而，非编码基因尤其是lncRNA的情况则十分不同，一个小的碱基缺失或者插入不一定会导致lncRNA功能缺失，如何对CRISPR/Cas9基因编辑技术进行进一步改进、以实现对包括lncRNA在内的所有基因或遗传元件的高效敲除是目前研究需要思考和解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双gRNA，该双gRNA比sgRNA分子具有更高的敲除效率。一种双gRNA(dualgRNA)，由第一启动子、gRNA-a、crRNA支架序列、第二启动子和gRNA-b顺次连接而成。一个双gRNA分子靶向作用于相同的基因或遗传元件，其中，gRNA-a和gRNA-b分别由不同的启动子控制其独立表达，并分别与同一靶基因上的两个靶位点互补配对。从而该双gRNA能够招募Cas9核酸酶在两个sgRNA作用位点对靶基因进行剪切，大大提高了靶基因的敲除效率。本专利技术还提供了一种双gRNA文库，该双gRNA文库包括针对靶基因的多个双gRNA，所述双gRNA的序列结构为：第一启动子-(gRNA-na)-crRNA支架序列-第二启动子-(gRNA-nb)；其中，n表示双gRNA的个数，n为≥1的整数。同一双gRNA文库中的双gRNA可以是仅针对一个靶基因设计的，也可以是针对多个靶基因设计的若干个双gRNA集的组合，一个双gRNA集针对一个靶基因。本专利技术中，所述第一启动子和第二启动子为互不相同的聚合酶III启动子，如H1启动子或U6启动子。本专利技术还提供了一种双gRNA载体文库，该载体文库由所述双gRNA文库与载体连接而成。本专利技术对载体无特殊要求，只要能够顺利转染细胞，使双gRNA能够在细胞内表达即可。作为优选，所述载体上带有报告基因或抗性基因。报告基因或抗性基因有利于挑取靶基因被敲除的阳性克隆。由于人工合成只能一次性获得长度大约为200nt的混合寡核苷酸，而本专利技术的双gRNA[第一启动子-(gRNA-a)-crRNA支架序列-第二启动子-(gRNA-b)]的总长度超过400nt，难以一次性合成获得。因此，本专利技术还提供了一种所述双gRNA载体文库的构建方法，该构建方法包括：(1)针对一个双gRNA作用位点，合成序列结构为“PCR扩增短序列I-(gRNA-a)-间隔序列-(gRNA-b)-PCR扩增短序列II”的单链寡核苷酸，其中，间隔序列的两端均带有II类限制性内切酶的酶切位点；其中，所述酶切位点可以是BsmBI、SapI、BSAI；所述PCR扩增短序列I的碱基序列为(如SEQIDNo.1所示)：5’-GTATGAGACCACTTGGATCC-3’；所述PCR扩增短序列II的碱基序列为(如SEQIDNo.2所示)：5’-CCTTATTTTAACTTGCTATT-3’；将针对同一靶基因合成的所有单链寡核苷酸等量混合，或者，将针对所有靶基因合成的单链寡核苷酸等量混合，获得混合单链寡核苷酸库；上述混合单链寡核苷酸库可以由美国customarray公司通过“定制芯片”的方法合成；(2)以步骤(1)中的混合单链寡核苷酸库为模板，利用相应的引物进行PCR扩增，获得混合双链寡核苷酸库；上下游引物分别与单链寡核苷酸中的PCR扩增短序列I和PCR扩增短序列II相结合，扩增获得混合双链寡核苷酸库；通过PCR扩增不仅可以获得双链寡核苷酸，以便后续连入载体中，而且能增加单链寡核苷酸的克隆数。(3)取经II类限制性内切酶线性化的载体，将步骤(2)中的混合双链寡核苷酸库连入该载体的第一启动子下游，获得前期文库；本步骤中的II类限制性内切酶可以与步骤(1)相同，也可以不同，只要该II类限制性内切酶能够在步骤(1)所述的酶切位点进行剪切即可。本专利技术对第一启动子、第二启动子的来源均无要求，第一启动子可以是载体自身带有的，也可以是重组到载体上的外源性第一启动子。(4)合成序列结构为“PCR扩增短序列I-crRNA支架序列-第二启动子-PCR扩增短序列II”的单链寡核苷酸库；其中，所述crRNA支架序列的碱基序列为(如SEQIDNo.3所示)：5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC--GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT-3’；本步骤中，PCR扩增短序列I和PCR扩增短序列II的碱基序列与步骤(1)中相同；(5)以步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双gRNA，其特征在于，由第一启动子、gRNA‑a、crRNA支架序列、第二启动子和gRNA‑b顺次连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种双gRNA，其特征在于，由第一启动子、gRNA-a、crRNA支架序列、第二启动子和gRNA-b顺次连接而成。2.一种双gRNA文库，其特征在于，该双gRNA文库包括针对靶基因的多个双gRNA，所述双gRNA的序列结构为：第一启动子-(gRNA-na)-crRNA支架序列-第二启动子-(gRNA-nb)；其中，n表示双gRNA的个数，n为≥1的整数。3.如权利要求2所述的双gRNA文库，其特征在于，第一启动子和第二启动子为互不相同的聚合酶III启动子。4.一种双gRNA载体文库，其特征在于，由权利要求2或3所述双gRNA文库与载体连接而成。5.如权利要求4所述双gRNA载体文库的构建方法，其特征在于，包括：(1)针对一个双gRNA作用位点，合成序列结构为“PCR扩增短序列I-(gRNA-a)-间隔序列-(gRNA-b)-PCR扩增短序列II”的单链寡核苷酸，其中，间隔序列的两端均带有II类限制性内切酶的酶切位点；将针对同一靶基因合成的所有单链寡核苷酸等量混合，或者，将针对所有靶基因合成的单链寡核苷酸等量混合，获得混合单链寡核苷酸库；(2)以步骤(1)中的混合单链寡核苷酸库为模板，利用相应的引物进行PCR扩增，获得混合双链寡核苷酸库；(3)取经II类限制性内切酶线性化的载体，将步骤(2)中的混合双链寡核苷酸库连入该载体的第一启动子下游，获得前期文库；(4)合成序列结构为“PCR扩增短序列I-crRNA支架序列-第二启动子-PCR扩增短序列II”...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁先锋，莫寅元，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33