一种用于制备6‑氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种用于制备6‑氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法。该方法包括以下步骤：(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.05‑0.35g/mL；(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化。本发明专利技术的方法操作简便、所得青霉素酰化酶的活性和收率较高。

For a fixed coupling and separation and purification methods of the preparation of 6 aminopenicillanic acid penicillin acylase

The present invention relates to the field of biological engineering, specifically relates to a method for coupling and immobilization of separation and purification methods of the preparation of 6 aminopenicillanic acid penicillin acylase. The method comprises the following steps: (1) inorganic salt mixed solution preparation containing penicillin acylase enzyme and inorganic salt concentration, the inorganic salts of the salt in the mixed solution of 0.05 0.35g/mL; (2) the step (1) of the inorganic salt mixed solution and tert butyl alcohol mixture, then to get rich phase, tert butanol phase in solid phase solution, and is rich in salt and penicillin acylase under aqueous solution system composed of three-phase distribution; (3) to step (2) immobilized in the solution phase adding penicillin acylase. The method of the invention is simple in operation and high in activity and yield of the obtained penicillin acylase.

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法。
技术介绍
青霉素酰化酶是制备β-内酰胺类抗生素的关键酶，工业生产中已成功将该酶应用于制备6-氨基青霉烷酸，多采用固定化酶形式。为制备出满足生产要求的固定化酶，首先将青霉素酰化酶从发酵液中分离纯化出来，然后进行酶的固定化。青霉素酰化酶的表达载体主要包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和毕赤酵母等。尽管表达载体不一样，但从发酵液中分离纯化青霉素酰化酶都面临一些共性问题：(1)去除发酵液中未消耗的培养基成分；(2)青霉素酰化酶内源表达，需要对菌体进行细胞破碎将酶释放出来；(3)去除细胞破碎后料液中的油脂、多糖、色素、氨基酸和细胞碎片等杂质；(4)去除细胞破碎后料液中的杂蛋白，提高青霉素酰化酶的纯度。为制备得到高纯度的青霉素酰化酶需要进行固液分离、浓缩、除杂和分离纯化等多步操作。作为工业酶，受成本所限无法采用层析技术等精细的分离技术，通常采用板框过滤、离心、硫酸铵沉淀、等电点沉淀和超滤等分离手段，并在此基础上进行组合形成相应的工艺。将本领域已知的青霉素酰化酶分离纯化与固定化工艺总结如下：(1)发酵液预处理：首先用高压匀浆或珠磨等机械法、有机溶剂或表面活性剂等化学法、溶菌酶等生物法对菌体进行细胞破碎，然后加入絮凝剂、助滤剂等，用离心或板框过滤进行固液分离得到不含菌体的粗酶液；(2)青霉素酰化酶的初分离：首先用酸或碱调至等电点沉淀的方法将部分杂蛋白去除，然后用离心或板框过滤得到青霉素酰化酶粗酶液，最后用膜过滤将青霉素酰化酶粗酶液浓缩到合适浓度；(3)青霉素酰化酶的精分离：首先对青霉素酰化酶粗酶液进行硫酸铵盐析，离心或板框过滤得到沉淀；然后用缓冲盐溶液溶解沉淀，离心或板框过滤去除不溶性固体；最后用膜过滤去除小分子杂蛋白、氨基酸、无机盐等杂质；(4)青霉素酰化酶的固定化：首先向精分离得到的青霉素酰化酶液中补加缓冲盐至合适浓度，离心或板框过滤去除固体杂质，然后加入环氧基载体或活化的氨基载体进行固定化。上述工艺存在的主要问题如下：(1)工艺步骤过于繁琐，操作时间长，导致生产效率低；(2)步骤多加上部分酶会因操作时间长而损失，导致酶的总收率低；(3)主要除杂方法为絮凝沉淀、硫酸铵沉淀、超滤和板框过滤(或离心)，分离手段比较传统，除杂效果不显著；(4)未从过程集成角度考虑固液分离、浓缩、除杂等分离纯化以及固定化操作之间的相互联系，导致步骤过多。因此，提供一种能够有效简化操作步骤、缩短操作时间，并能够有效提高酶分离纯化的总收率的新的青霉素酰化酶的分离纯化方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法。本专利技术的方法操作简便、所得青霉素酰化酶的活性和收率较高。本专利技术的专利技术人发现，通过采用有机溶剂-无机盐的体系，通过严格控制无机盐的浓度，可以形成三相分配体系，并能够将青霉素酰化酶富集到下相溶液中(如果进入上相溶液中，一方面容易使酶失活，另一方面无法直接进行固定化；如果富集到中相(固体相)，无法直接进行固定化，需要额外增加操作步骤)；从而，可以在该下相溶液中直接进行青霉素酰化酶的固定化；由此，本专利技术的方法可以将传统方法的各个步骤在一个单元操作完成，极大地简化了工艺，从而成为一种极具前景的过程集成技术。本专利技术的专利技术人还发现，相比现有技术使用的其他种类的醇，叔丁醇能够最大限度地保持青霉素酰化酶的活性。本专利技术提供了一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.05-0.35g/mL；(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化。本专利技术的方法与现有技术相比所存在的优势至少在于：(1)本专利技术的方法将青霉素酰化酶的分离纯化涉及的固液分离、初分离和精分离中的多个操作单元在一个操作单元中完成，并将酶的分离纯化与固定化耦合，大大简化了操作步骤、缩短了操作时间、提高了酶提取的总收率；(2)本专利技术的方法省去了多步板框过滤或离心、1-2步膜过滤操作，减少了污水排放，降低了生产成本，提高了生产效率；(3)本专利技术的方法分离纯化青霉素酰化酶的总收率显著高于现有技术；(4)本专利技术的方法制备得到的固定化酶的酶活显著提高；(5)本专利技术所用的叔丁醇可回收后重复使用，进一步降低了生产成本；(6)本专利技术的方法的放大效应小，很有工业化应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本专利技术提供了一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.05-0.35g/mL；(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化。本专利技术进行分离纯化与固定化的对象为用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶，该酶属于青霉素酰化酶的一种，并且是特定地用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶，即术语“用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶”在本专利技术中指的是这种特定的青霉素酰化酶。在本专利技术中为了描述方便，将“用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶”简称为“青霉素酰化酶”，即在本文本中所述“青霉素酰化酶”均指的是“用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶”。本专利技术的专利技术人发现，在步骤(1)中所得无机盐混合溶液中无机盐的浓度能够显著地影响到是否能够在第(2)步中得到三相分配体系，一般来说，所述无机盐混合溶液中所述无机盐的浓度达到上述的0.05-0.35g/mL即可以使得在步骤(2)中得到三相分配体系，在优选的情况下，所述无机盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.15-0.3g/mL，更优选为0.2-0.25g/mL。在步骤(1)中，所述无机盐混合溶液的pH为5-9，有利于维持青霉素酰化酶的酶活不受损失。为了能够更好地形成三相分配体系并且使青霉素酰化酶尽可能地全部进入下相溶液中，所述无机盐混合溶液的pH优选为5-8，最优选为6-8，进一步优选为7-8。在步骤(1)中，所述无机盐可以为水溶性磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和卤化物中的一种或多种。其中，所述水溶性磷酸盐例如为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾、磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备6‑氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.05‑0.35g/mL；(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶的分离纯化与固定化耦合方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)制备含有青霉素酰化酶粗酶液和无机盐的无机盐混合溶液，该含盐混合溶液中所述无机盐的浓度为0.05-0.35g/mL；(2)将步骤(1)所得无机盐混合溶液与叔丁醇混合，然后进行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固体以及富含盐和青霉素酰化酶的下相溶液组成的三相分配体系；(3)向步骤(2)所得下相溶液中加入载体进行青霉素酰化酶的固定化。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述无机盐混合溶液的pH为5-9，所述无机盐混合溶液中无机盐的浓度为0.15-0.3g/mL；优选地，所述无机盐混合溶液的pH为5-8，所述无机盐混合溶液中无机盐的浓度为0.2-0.3g/mL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述无机盐为水溶性磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和卤化物中的一种或多种；优选为水溶性磷酸盐和/或硫酸盐，最优选为水溶性磷酸盐。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述青霉素酰化酶粗酶液为经细胞破碎后未处理的用于制备6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶粗酶液，或者为经细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王旭东，修志龙，董悦生，王启斌，
申请(专利权)人：山西新国大医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14