一种提高丙酸发酵效率的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高丙酸发酵效率的方法，具体涉及一种采用二次接种的方式提高丙酸发酵效率的方法，所述方法包括如下步骤：(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；(3)二次接种：在发酵到84‑156h时以5‑20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。本发明专利技术方法在传统批次发酵的基础上通过在特定的时间点二次接入新鲜的种子液，提高了菌株在发酵后期相对恶劣条件下的生长代谢能力，进而提高了菌株的生产性能；且该方法特异的针对丙酸发酵效果显著，在未延长发酵周期的情况下，底物的转化率提高了6％以上，丙酸的产量提高了6％以上。

Method for improving fermentation efficiency of propionic acid

The invention relates to a method for improving the efficiency of propionic acid fermentation, in particular relates to a method of using the two inoculation method to improve propionic acid fermentation efficiency. The method comprises the following steps: (1): strain activation of Propionibacterium preserved activation; (2): Live Propionibacterium fermentation after transfer to the fermentation of the fermentation medium; (3) two times: in 84 inoculation fermentation to 156h with inoculation of 5 20% will be two times of inoculation of propionibacterium. The method of the invention is based on traditional batch fermentation by at specific time points two times access to fresh seed liquid, improve the strain in the late fermentation stage relatively harsh conditions of growth ability, and improve the production performance of strains; and the method is specific for propionic acid fermentation effect, without prolonging the fermentation cycle under the condition, the conversion rate of the substrate is improved by more than 6%, the yield of propionic acid increased more than 6%.

【技术实现步骤摘要】
一种提高丙酸发酵效率的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种提高丙酸发酵效率的方法，具体涉及一种采用二次接种的方式提高丙酸发酵效率的方法。
技术介绍
产酸丙酸杆菌菌株(Propionibacteriumacidipropionici)是微生物发酵生产丙酸的生产菌种，其发酵过程中产生的丙酸主要存在于发酵液中，但是丙酸的不断积累会对菌体细胞生长以及丙酸自身代谢产生反馈抑制作用，进而降低了发酵效率。为了提高发酵效率，研究人员对生产菌株进行了基因改造(BiotechnologyandBioengineering,2009,104:766-773；MetabolicEngineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反馈抑制机理(JournalofBiotechnology,2013,167:56-63)，并采用了过程工程手段将发酵液中的丙酸移除，减缓了其对发酵的抑制作用(AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2001,56:676-680；BioresourceTechnology,2012,112:248-253；BioresourceTechnology,2012,104：652-659)。上述方法均可以有效提高发酵过程中的底物转化效率和丙酸产量，但是，在实际生产过程中，均需要在原有发酵设备的基础上，增加其他的外接操作单元，如膜分离设备、层析分离设备等，使得发酵工艺变得复杂、操作变得繁琐。目前，已有技术公开了通过“二次接种”的方式来再次发酵，CN103478417A公开了一种二次接种分段固态发酵生产发酵豆粕的方法，首先将枯草芽孢杆菌液、假丝酵母菌液和乳酸杆菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合发酵；然后将乳酸杆菌液接入到发酵物中，混合，厌氧发酵，得到发酵豆粕。该方法采用二次接种，将不同的菌株分开接种的方式，以满足好氧菌和厌氧菌的不同发酵需求，但其对于产酸丙酸杆菌菌株生产丙酸并不适用。CN101012465A公开了一种二次接种叠加生物素的谷氨酸发酵生产方法，该方法以生物素缺陷型谷氨酸产生菌株为生产菌株，在营养条件丰富的情况下，采用二级接种使得菌体细胞和生物素保持“超亚适量”状态，不仅解决了发酵供氧的问题，还克服了夏季高温环境下的发酵热问题，提高了生产效率。但是，丙酸杆菌发酵过程中存在严重的产物反馈抑制作用，与谷氨酸发酵生产时菌体细胞的生长环境差异甚大，因此，不适用于产酸丙酸杆菌菌株生产丙酸的情况。由此可见，如何针对发酵过程中营养条件匮乏、有害代谢产物不断积累、产物的反馈抑制作用，以及菌株生长性能和代谢活力不断减弱，适应性降低等情况，提供一种即可以提高发酵效率，而又无需额外添加操作单元的方式就显得尤为重要。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种提高丙酸发酵效率的方法，所述方法通过采用“二次接种”的方法，即在发酵过程中补接新鲜的种子液，提高了菌株的生产性能，所述方法操作简单，不会延长发酵周期，而且不增加任何设备投资，便于工业化生产。为达此目的，本专利技术采用了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种提高丙酸发酵效率的方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；(3)二次接种：在发酵到80-156h时以5-20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。本专利技术中，所述二次接种的菌种与接种量与第一次发酵前接种的菌种与接种量相同，菌种均是丙酸杆菌，所述方法通过在特定的时间点二次接入新鲜的种子液，提高了菌株的生产性能，提高了底物的转化率，且该方法特异的针对丙酸发酵效果显著，且经过二次接种，整个发酵的周期没有延长。本专利技术中，所述丙酸杆菌来自于微生物菌株保藏中心，保藏编号为CMCC1.2230。根据本专利技术，步骤(1)所述的活化具体包括：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养。本专利技术中，所述丙酸杆菌保存在甘油管或斜面培养基中，所述甘油管或斜面培养基只要能够用于保存丙酸杆菌的都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要自行选择，示例性地，所述斜面培养基包括如下组分：20g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、2g/L硫酸铵、2g/L碳酸钙和15g/L琼脂。优选地，所述转接的接种量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，优选为10％。根据本专利技术，所述一级种子培养基和二级摇瓶种子培养基的培养基成分是相同的，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾。优选地，所述种子培养基的pH为6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为6.8-7.0。根据本专利技术，所述丙酸杆菌在一级种子培养基和在二级摇瓶种子培养基中的培养条件是相同的。优选地，所述静置培养的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为30℃。优选地，所述静置培养的时间为40-55h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h或55h，优选为48h。优选地，步骤(2)所述转接的接种量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，优选为10％。优选地，步骤(2)发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和磷酸二氢钾4-5g/L，优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾。所述葡萄糖例如可以是55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L或65g/L；所述玉米浆例如可以是35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L或45g/L；所述磷酸二氢钾例如可以是4g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L或5g/L。优选地，所述发酵培养基的pH为6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为6.8-7.0。本专利技术中，所述发酵培养基的pH通过流加弱碱来维持pH的恒定，只要能够调节pH的弱碱都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要自行选择，本专利技术中采用氨水进行调节pH。根据本专利技术，所述发酵培养中的葡萄糖浓度不低于10g/L。本专利技术中随着发酵的进行，葡萄糖不断消耗，通过实时监测葡萄糖浓度，补加葡萄糖来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高丙酸发酵效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；(3)二次接种：在发酵到84‑156h时以5‑20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。

【技术特征摘要】
1.一种提高丙酸发酵效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；(3)二次接种：在发酵到84-156h时以5-20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的活化具体包括：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养；优选地，所述转接的接种量为5-20％，优选为10％。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾；优选地，所述种子培养基的pH为6-7.5，优选为6.8-7.0。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述静置培养的温度为25-35℃，优选为30℃；优选地，所述静置培养的时间为40-55h，优选为48h。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述转接的接种量为5-20％，优选为10％；优选地，步骤(2)发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾，优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾；优选地，所述发酵培养基的pH为6-7.5，优选为6.8-7.0。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王自强，孙丹，王云山，苏志国，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11