一种抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和在抗乳腺癌、抗黑色素瘤药物方面领域的应用。鲜冬虫夏草提取物由如下方法制备而成：将鲜冬虫夏草破碎后加水匀浆，之后对冬虫夏草进行低温超声辅助提取，离心，取上清，浓缩，醇沉，收集沉淀，冷冻干燥得到冬虫夏草提取物。本发明专利技术得到的鲜冬虫夏草提取物具有明显的抑制乳腺癌细胞增殖和抗黑色素瘤转移作用，且有效成分明确，可用于预防癌症、治疗癌症，具有良好的药用前景；制备过程中不引入有毒有害的有机溶剂，使用安全；制备工艺简单，易于大规模生产。

Antitumor active Cordyceps Extract, preparation method and application thereof

The invention discloses a fresh Cordyceps Extract with anti-tumor activity, a preparation method thereof and the application in the field of anti breast cancer and anti melanoma medicine. Fresh Cordyceps sinensis extract prepared by the following methods: fresh water homogenate after crushing Cordyceps, Cordyceps sinensis were of low temperature ultrasonic assisted extraction, centrifugation, Torikami Kiyo, concentration, alcohol precipitation, precipitation collection, by freeze drying of Cordyceps extract. Fresh Cordyceps sinensis extract obtained by the invention has anti melanoma and breast cancer cell proliferation and metastasis significantly, definite effective ingredients and can be used for the prevention of cancer, cancer treatment, has good prospects for medicinal preparation; introduction of organic solvent, toxic and harmful in the process of using safety; the preparation process is simple, easy to scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和应用
本专利技术涉及中药和天然药物领域，具体涉及一种抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和在抗乳腺癌、抗黑色素瘤转移药物方面领域的应用。
技术介绍
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是我国特产的名贵中药，具有补肺益肾、止血化痰等功效。现代医学研究表明，冬虫夏草具有抗肿瘤、调节免疫力、降血压、调节内分泌、镇静、抗心肌缺血以及调节心率等功能。近年来，大量的文献报道了冬虫夏草及其活性成分对胃癌、肺癌、甲状腺癌等多种肿瘤细胞的生长及转移具有抑制作用，但是其中对乳腺癌、黑色素瘤的研究相对较少。同时，在制备冬虫夏草提取物样品时多采用煮沸、高温超声提取或高温回流提取，这些制备方法会造成部分活性物质结构的变化，导致冬虫夏草的药理活性受到影响。黑色素瘤(melanoma)是一种侵袭性强的皮肤肿瘤，近年来随着发病率明显上升，逐渐成为常见恶性肿瘤。其进展迅速，极易转移，临床预后极差，严重危害人类健康。B16黑色素瘤是1954年发现的，该瘤是自发于纯系鼠C57BL/6耳根皮肤的色素瘤，有文献报道B16黑色素瘤的肺转移率大于90％。现有文献报道冬虫夏草对肿瘤细胞转移方面研究很少，只有少量关于冬虫夏草菌丝体的相关研究，且研究很不深入，多采用热水长时间提取或者有机溶剂提取。如王琳等在《冬虫夏草对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的影响》中报道了冬虫夏草菌丝体粉末以90～95℃热水提取3h，可使肺表面转移结节数减少，其最适剂量为250mg/kg，但是并未提到抑制黑色素瘤的转移率和对小鼠生活质量的影响。又如文献《InhibitoryeffectsofethylacetateextractofCordycepssinensismyceliumonvariouscancercellsincultureandB16melanomainC57BL-6mice》报道了冬虫夏草人工发酵菌丝体的乙酸乙酯提取物对MCF-7乳腺癌细胞和B16黑色素瘤细胞具有很好的抑制作用，而其热水提取物则无抑制作用。乳腺癌已成为当今世界女性最常见的恶性肿瘤。据陈万青博士在《中国女性乳腺癌发病死亡和生存状况》中记载，根据全国肿瘤登记中心数据资料评估，2011年中国女性乳腺癌发病人数约24.9万，发病率37.86/10万，近十年发病呈上升趋势。每年死亡约6.0万，死亡率9.21/10万，近十年乳腺癌死亡率呈上升趋势。随着社会经济发展，女性生活方式发生显著改变，乳腺癌相关危险因素普遍存在，预计未来较长一段时期我国乳腺癌的发病率和死亡率还将持续上升。由于化学合成药物对患者会产生毒副作用及耐药性等问题，筛选天然药物作为肿瘤治疗的候选或辅助药物已成为研究的热点。有研究表明，冬虫夏草对乳腺癌细胞的生长或转移有一定的抑制作用。然而现有的文献一般是将烘干、晒干或冬虫夏草发酵液作为研究对象，且将冬虫夏草原料进行高温水煮提取，如《Activationofinnateimmunitytoreducelungmetastasesinbreastcancer》报道了采用沸水提取冬虫夏草菌丝体粉末1h后获得的水提物在浓度为3.4mg/mL时对4T1乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用。文献《冬虫夏草对乳腺癌细胞凋亡的诱导及相关基因表达的调控》报道了冬虫夏草菌发酵液在浓度为1.0～50μg/mL浓度范围内对MCF-7细胞的增殖有抑制作用，呈现浓度和时间依赖性。研究表明，乳腺癌患者中存在雌激素受体(ER)阳性(ER+)和阴性(ER+)两种类型，同时还存在表皮生长因子2(HER2)低表达与高表达两种类型。其中MCF-7细胞是保留野生型P53，ER阳性的乳腺癌细胞株，而MDA-MB-453是表达突变型P53，ER阴性的乳腺癌细胞株。大量研究表明，有30％的乳腺癌患者HER2基因过度表达，这类患者肿瘤恶性程度高，复发和转移发生早，预后差，对某些化疗药物存在抵抗。
技术实现思路
本专利技术通过对鲜冬虫夏草进行深入研究，提供一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和在抗肿瘤活性方面的应用。本专利技术涉及的具有抗乳腺癌活性的鲜冬虫夏草提取物活性成分明确、安全有效、质量可控，对黑色素肿瘤细胞转移也有很好的功效，具有很好的开发前景。此外，本专利技术还涉及具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，该方法条件温和，可最大限度保护提取物的活性成分，且操作简单，重复性强，在制备过程中不引入有毒有害有机溶剂，为提取冬虫夏草活性成分的研究提供了一种新的方法和思路。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一方面，本专利技术提供一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物，其特征在于，鲜冬虫夏草提取物中多糖含量为69.4～76.7％，蛋白含量为10.2～14.3％。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物，其中，多糖包含3种分子量大于1KDa的多糖，重均分子量分别为2.7KDa，29KDa和1422KDa；蛋白的分子量分布范围主要存在于10～15KDa和20～37KDa处。另一方面，本专利技术涉及一种本专利技术所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a、将鲜冬虫夏草破碎，加水匀浆，粉碎，控制温度为15～25℃；b、将匀浆后的鲜冬虫夏草进行超声提取，控制温度为15～25℃，离心得上清液，然后将鲜冬虫夏草残渣于-20℃冷冻静置；c、将冷冻的鲜冬虫夏草残渣取出，加水匀浆并分散均匀，再次超声提取，控制温度为15～25℃，然后离心，得上清液，合并步骤b的上清液；d、往离心后的上清液中加无水乙醇至浓度为60～80％后，在4℃下静置过夜；于4℃下冷冻离心，收集沉淀；e、将沉淀进行冷冻干燥，得鲜冬虫夏草提取物。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤a中，所述的鲜冬虫夏草和水的重量体积比为1:8～12g/mL，匀浆时间为4～8min，匀浆转速为14000～18000rpm。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤b中，超声提取时间为20～40min，超声功率为400～600W，离心时间为10～15min，离心转速为8000～10000rpm，冷冻静置时间为20～60min。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤c中，鲜冬虫夏草残渣和水的重量体积比为1:8～12g/mL，再次匀浆时间为4～8min，匀浆转速为14000～18000rpm，再次超声提取时间为20～40min，超声功率为400～600W，离心时间为10～15min，离心转速为8000～10000rpm。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤d中，冷冻离心的时间为15～25min，离心的转速为8000～10000rpm。在一些实施例中，本专利技术所述的一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，所述的制备方法包括下述步骤：a、将鲜冬虫夏草破碎，按鲜冬虫夏草与水的重量体积比加入1:8～12g/mL的水，匀浆4～8min，匀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物，其特征在于，鲜冬虫夏草提取物中多糖含量为69.4～76.7％，蛋白含量为10.2～14.3％。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物，其特征在于，鲜冬虫夏草提取物中多糖含量为69.4～76.7％，蛋白含量为10.2～14.3％。2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物，其特征在于，所述多糖包含3种分子量大于1KDa的多糖，重均分子量分别为1422KDa，29KDa和2.7KDa；所述蛋白的分子量分布范围主要存在于10～15KDa和20～37KDa处。3.一种权利要求1～2任一项所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a、将鲜冬虫夏草破碎，加水匀浆，粉碎，控制温度为15～25℃；b、将匀浆后的鲜冬虫夏草进行超声提取，控制温度为15～25℃，离心得上清液，然后将鲜冬虫夏草残渣于-20℃冷冻静置；c、将冷冻的鲜冬虫夏草残渣取出，加水匀浆并分散均匀，再次超声提取，控制温度为15～25℃，然后离心，得上清液，合并步骤b的上清液；d、往离心后的上清液中加无水乙醇至浓度为60～80％后，在4℃下静置过夜；于4℃下冷冻离心，收集沉淀；e、将沉淀进行冷冻干燥，得鲜冬虫夏草提取物。4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤a中，所述的鲜冬虫夏草和水的重量体积比为1:8～12g/mL，匀浆时间为4～8min，匀浆转速为14000～18000rpm。5.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤b中，超声提取时间为20～40min，超声功率为400～600W，离心时间为10～15min，离心转速为8000～10000rpm，冷冻静置时间为20～60min。6.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物的制备方法，其中，在步骤c中，所述的鲜冬虫夏草残渣和水的重量体积比为1:8～12g/mL，再次匀浆时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱正明，肖瑛，甄达明，李春红，蔡宏伟，温宝庆，陈荣升，唐新发，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，宜昌山城水都冬虫夏草有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44