植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法技术

本发明专利技术提供一种植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法，其是通过本发明专利技术的微电极生物传感器，实现植物体内还原型谷胱甘肽的在线原位活体检测，采用微创方式，对待测目标造成的伤害极小，使得被测目标可继续生长，检测方法可靠，灵敏度高，测定结果准确，并且由于是在体检测，可以减少样本处理时间，避免因处理过程中目标物质的分解、氧化等造成的误差，对还原型谷胱甘肽的生理反应响应灵敏度检测效率高于其他检测方法。

【技术实现步骤摘要】
植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法
本专利技术涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法。
技术介绍
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含巯基的低分子肽，是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽(L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)，分子式为C10H17O6SN3。GSH作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。谷胱甘肽分为氧化型(GSSG)和还原型(GSH)，通常所说的谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽，其半胱氨酸上的巯基是其发挥生物学功能所必需的。还原型谷胱甘肽是植物中含量最丰富的含巯基的低分子肽，为植物机体内的重要活性物质，它参与二硫化物、硫醚和硫酯的形成，并能清除生物体内的自由基，是胞内代谢过程和植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物的最有效的清除剂之一。植物体内的氧化型谷胱甘肽可以转化为还原型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽含量的比值是反映植物体内谷胱甘肽活性的重要指标，高GSH/GSSG比值则有利于蛋白质的合成。另外还有很多研究表明，GSH是植物体内还原型硫的重要贮藏和运输形式，具有提高植物的抗旱、抗寒性，减轻重金属的毒害等作用。在植物抗逆过程中直接或间接地参与了许多植物的功能活动。目前植物中测定谷胱甘肽含量的方法很多，如荧光分光光度法、可见分光光度法、紫外分光光度法、碘量法和近些年来发展的HPLC法等，这些方法均是通过对植物组织进行取样，研磨提取后进行检测，属于离体检测技术，获取到的信息也是某一时刻的静态浓度或累积效应，不能反映植物体内还原型谷胱甘肽的瞬时或连续的变化，因此受到技术手段的限制，现阶段针对GSH在植物体内合成、降解、运输的调控机制及对植物抗氧化作用机理等还有很多方面仍不清楚，迫切需要引入新技术和新方法推进研究的深入。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于生物传感技术的植物还原型谷胱甘肽的活体原位在线检测方法，以克服现有技术中需要离体取样，时空分辨率较低，不能实现瞬时和长时间连续监测的缺陷。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种微电极生物传感器，所述微电极的基底电极材料为硅片，硅片上设有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极。谷胱甘肽氧化酶(glutathioneoxidase，GSHOx)可以催化谷胱甘肽生成谷胱甘肽二硫化物(glutathionedisulfide)，通过计时电流法记录酶催化谷胱甘肽变化的实时响应。本专利技术的微电极可以是贴片式或插入式微电极。所述微电极为贴片式微电极，表面贴有保护膜；所述贴片式微电极的工作电极为直径5-10mm的金属圆片，参比电极为直径8-16mm的圆环，环宽为2-3mm，长度为3/5整环周长，对电极是与参比电极相同直径和宽度的圆环，长度为1/4整环周长，参比电极和对电极分别呈环形半包围于所述金属圆片的外侧，硅片上设置有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站。所述硅片基底呈薄片状，厚度小于2mm，金属电极片厚度小于1mm。所述微电极为插入式微电极；所述插入式微电极长2-8cm，其尖端部分长5-30mm，宽2-5mm；所述硅片基底的尖端上中间布设有金工作电极，两边分别布设Ag/AgCl参比电极、铂对电极；裸露金工作电极直径0.5-2mm，Ag/AgCl参比电极直径0.2-0.5mm，铂对电极直径0.2-0.5mm；硅片基底的另一端较宽，其上布设有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站。所述微电极生物传感器的制备方法包括以下步骤：1)采用微机电技术(MEMS)在硅片基底上制备铂对电极、Ag/AgCl参比电极以及金工作电极；2)将制备好的微电极置于0.5M稀硫酸溶液中，在-0.2-1.6V电位下进行循环伏安扫描，得到典型的循环伏安谱图，保证电极表面清洁；3)制备Fe3O4NPs纳米颗粒：取摩尔质量比为20:1的FeCl3和FeCl2溶解在双蒸水中，加入一定量的盐酸使铁盐完全溶解，然后向其中逐滴加入氢氧化钠溶液至溶液颜色由淡黄色变为棕色最后直至深黑色；用磁铁将黑色沉淀物收集在一起，水洗，然后用TMOH冲洗一次，离心，收集沉淀，得到氧化Fe3O4NPs颗粒，将沉淀用硝酸洗一次，然后在80-90℃搅拌条件下，使颗粒悬浮于0.01-3M硝酸中，直至变成棕色；最后经过水洗，将Fe3O4NPs纳米颗粒悬浮于pH值11的TMOH溶液中；4)取上述Fe3O4NPs纳米颗粒TMOH悬浮溶液，用1-100mM柠檬酸钠溶液稀释，搅拌10min以上，使柠檬酸根离子均匀包裹住Fe3O4纳米颗粒；用磁铁收集柠檬酸根化的Fe3O4纳米颗粒，并重新分散到1-100mM柠檬酸钠溶液中使其浓度为0.1-5mg/ml，加入终浓度为0.1-100mM的硝酸银溶液，超声15min，搅拌下加热至沸腾，立即加入硼氢化钠溶液，硼氢化钠与硝酸银的摩尔质量比为1:1-1:200，10-60min后停止加热持续搅拌至冷却，得到Fe3O4-Ag核壳结构纳米粒子；5)将Fe3O4-Ag核壳结构纳米粒子沉积在金工作电极上，得到Fe@Ag/Au电极；6)制备壳聚糖与谷胱甘肽氧化酶混合液：将pH值7.3的PBS缓冲液配制的18mg/mL谷胱甘肽氧化酶酶液与1.0％壳聚糖溶液等体积混合；其中，所述1.0％壳聚糖溶液的配制方法如下：将0.1g壳聚糖溶解在10mL0.05M醋酸溶液中，然后经孔径0.45μm的滤膜过滤，即得；7)将步骤6)所得混合液滴涂在Fe@Ag/Au电极表面，晾干，即得表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极，从而完成微电极生物传感器的制备。本专利技术中使用的水为双蒸水。本专利技术还提供利用所述微电极生物传感器对植物体内还原型谷胱甘肽进行原位在线检测的方法。以黄瓜、番茄、向日葵、棉花等植物作为试验材料，以还原型谷胱甘肽作为检测对象。采用瑞士万通Autolab电化学工作站、贴片式或插入式微电极，通过电化学方法对幼苗子叶、茎秆或果实中的还原型谷胱甘肽含量进行活体在线监测。检测前选取不同浓度的还原型谷胱甘肽标准溶液进行微电极检测，根据还原型谷胱甘肽浓度与电流关系绘制谷胱甘肽的标准曲线；所述微电极最低检测限为0.05mmol/L，线性范围为0.1-100mmol/L，还原型谷胱甘肽溶液浓度与响应峰电流的线性方程为y＝0.2668ln(x)+4.8799，相关性系数为0.9816。在0.4V工作电位下，采用计时电流法进行植物组织内还原型谷胱甘肽的实时在线监测；从电流平稳后开始计时，采集第20分钟左右的电流数据代入线性方程，得到植物组织中还原型谷胱甘肽的浓度。本专利技术的检测对象包括植物的茎、叶或果实等部位。针对不同部位，选择不同形式的传感器，贴片式传感器适用于叶片，插针式传感器适用于茎和果实。在本专利技术的一个具体实施方式中，分别以黄瓜叶片和番茄果实为检测对象。当使用插入式微电极对茎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极的基底电极材料为硅片，硅片上设有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极。

【技术特征摘要】
1.一种微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极的基底电极材料为硅片，硅片上设有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极。2.根据权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极为贴片式微电极，表面贴有保护膜；所述贴片式微电极的工作电极为直径5-10mm的金属圆片，参比电极为直径8-16mm的圆环，环宽为2-3mm，长度为3/5整环周长，对电极是与参比电极相同直径和宽度的圆环，长度为1/4整环周长，参比电极和对电极分别呈环形半包围于所述金属圆片的外侧，硅片上设置有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站；所述硅片基底呈薄片状，厚度小于2mm，金属电极片厚度小于1mm。3.根据权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极为插入式微电极；所述插入式微电极长2-8cm，其尖端部分长5-30mm，宽2-5mm；所述硅片基底的尖端上中间布设有金工作电极，两边分别布设Ag/AgCl参比电极、铂对电极；裸露金工作电极直径0.5-2mm，Ag/AgCl参比电极直径0.2-0.5mm，铂对电极直径0.2-0.5mm；硅片基底的另一端较宽，其上布设有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站。4.根据权利要求1-3任一项所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极生物传感器的制备方法包括以下步骤：1)采用微机电技术在硅片基底上制备铂对电极、Ag/AgCl参比电极以及金工作电极；2)将制备好的微电极置于0.5M稀硫酸溶液中，在-0.2-1.6V电位下进行循环伏安扫描，得到典型的循环伏安谱图，保证电极表面清洁；3)制备Fe3O4NPs纳米颗粒：取摩尔质量比为20:1的FeCl3和FeCl2溶解在双蒸水中，加入一定量的盐酸使铁盐完全溶解，然后向其中逐滴加入氢氧化钠溶液至溶液颜色由淡黄色变为棕色最后直至深黑色；用磁铁将黑色沉淀物收集在一起，水洗，然后用TMOH冲洗一次，离心，收集沉淀，得到氧化Fe3O4NPs颗粒，将沉淀用硝酸洗一次，然后在80-90℃搅拌条件下，使颗粒悬浮于0.01-3M硝酸中，直至变成棕色；最后经过水洗，将Fe3O4NPs纳米颗粒悬浮于pH值11的TMOH溶液中；4)取上述Fe3O4NPs纳米颗粒TMOH悬浮溶液，用1-100mM柠檬酸钠溶液稀释，搅拌10min以上，使柠檬酸根离子均匀包裹住Fe3O4纳米颗粒；用磁铁收集柠檬酸根化的Fe3O4纳米颗粒，并重新分散到1-100mM柠檬酸钠溶液中使其浓度为0.1-5mg/ml，加入终浓度为0.1-100...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓冬，王成，李爱学，胡叶，侯佩臣，何璐璐，周航，罗斌，宋鹏，潘大宇，
申请(专利权)人：北京农业信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11