一种测定富硒酵母中无机硒和有机硒含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定富硒酵母中无机硒的含量的方法，包括以下步骤：(1)称取富硒酵母，向富硒酵母中加入强碱溶液，超声，使富硒酵母溶解，再进行水浴加热；其中，所述富硒酵母的质量与强碱溶液中氢氧根离子的物质的量的比为1g：15～35mmol；(2)加热完后，进行冷却，再离心，取上清液；(3)调节步骤(2)所得上清液的酸度至pH值为4～5，静置后过滤，得到滤液；(4)向步骤(3)所得滤液中加入6～12mol/L盐酸水溶液，煮沸后进行稀释，采用原子荧光光度计测定稀释所得溶液中的硒含量。本发明专利技术所述的测定无机硒的方法操作简单，精密度高，回收率好。

【技术实现步骤摘要】
一种测定富硒酵母中无机硒和有机硒含量的方法
本专利技术涉及一种测定硒含量的方法，尤其涉及一种测定富硒酵母中有机硒和无机硒含量的方法。
技术介绍
硒具有抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能，是动物的重要营养元素之一，广泛用于饲料添加剂中，硒的主要添加形式有无机亚硒酸钠盐和有机硒酵母，亚硒酸钠毒性高、不易被动物吸收利用，易造成浪费和环境污染，目前大多数地区已被禁止使用，而硒酵母由于其代谢周期长，生物利用率高，毒性低等特点。硒酵母中主要是以-2价存在的硒蛋白、核酸、多脂类的有机硒，和少量的亚硒酸钠、硒酸钠。因此，检测硒酵母中无机硒和有机硒的含量，在饲料安全使用中具有重要意义。目前，硒酵母作为一种重要饲料添加剂，总硒的测定方法主要有二氨基联苯紫外分光光度法、原子荧光分光光度法、电感耦合等离子法，其中氢化物原子荧光光度法已引入国家标准法中；有机硒的测定方法目前还没有唯一标准，报道较多的主要有质谱-高效液相色谱法，衍生-高效液相色谱法，ICP-MS(RajaniJagtap，2016)或HPLC-HG-AFS(王金荣，2013)等，但这些方法对仪器要求较高，试剂昂贵，一般实验室难以实现，操作繁琐，测试周期较长，且成本较高不适合广泛推广，此外，还有一些方法采用有机缓冲溶液浸提、透析分离的方法测定有机硒(高建忠，2006)，但这种方法耗时较长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种测定时间短、简单且易于实施的测定富硒酵母中无机硒含量的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种测定富硒酵母中有机硒含量的方法。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：一种测定富硒酵母中无机硒的含量的方法，包括以下步骤：(1)称取富硒酵母，向富硒酵母中加入强碱溶液，超声，使富硒酵母溶解，再进行水浴加热；其中，所述富硒酵母的质量与强碱溶液中氢氧根离子的物质的量的比为1g：15～35mmol(即按照每克富硒酵母中加入15～35mmol强碱溶液的比例，向富硒酵母中加入强碱溶液；其中，强碱溶液中强碱的物质的量按强碱中氢氧根离子的物质的量计)；(2)加热完后，进行冷却，再离心，取上清液；(3)调节步骤(2)所得上清液的酸度，至上清液的pH值为4～5，静置后过滤，得到滤液；(4)向步骤(3)所得滤液中加入6～12mol/L的盐酸水溶液，煮沸后进行稀释，采用原子荧光光度计测定稀释所得溶液中的无机硒的含量。作为本专利技术所述测定富硒酵母中无机硒的含量的方法的优选实施方式，其中，在所述步骤(1)中，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的至少一种。更优选地，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液。更优选地，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.15～0.35mol/L，更优选地，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.25mol/L。值得注意的是，氢氧化钠的浓度对硒酵母中无机硒的提取效果影响较大，经过大量的实验，专利技术人发现当氢氧化钠水溶液的浓度在0.15～0.35mol/L的范围内，都能取得较为理想的提取效果。作为本专利技术所述测定富硒酵母中无机硒的含量的方法的优选实施方式，其中，在所述步骤(1)中，所述水浴温度为45～65℃，当水浴温度在该范围内时，对于富硒酵母中无机硒的提取效果影响较小。更为优选地，所述水浴温度为65℃。在所述步骤(1)中，水浴时间取决于水浴温度，在可选择的范围(即45～65℃)内，当温度相对较高时，水浴时间相对较短，反之。但是，当水浴时间超过30分钟，对于富硒酵母中无机硒提取的效果并没有明显的提高。作为本专利技术所述测定富硒酵母中无机硒的含量的方法的优选实施方式，其中，在所述步骤(3)中，将上清液的pH调至4.5，这是因为pH＝4.5是富硒酵母中蛋白质的等电点，在该pH下，富硒酵母中蛋白质的溶解度最小。更为优选地，用盐酸将上清液的pH调至4.5，从而避免过多物质引入待检测的溶液中。作为本专利技术所述测定富硒酵母中无机硒的含量的方法的优选实施方式，其中，原子荧光光度计的工作参数设置为：仪器工作负高压：280V，空心阴极灯电流：80mA，载气流量：400mL/min，屏蔽气流量：900mL/min，原子化炉高度：8mm，读数时间：15s，延迟时间：3s，载液：5％HCl(质量百分比浓度)，还原剂：2％KBH4+0.5％NaOH。值得注意的是，原子荧光光度原理上只能测定+4价硒的含量，富硒酵母中存在+6，+4，-2价三种硒形态，其中-2价存在的为有机硒(大量硒蛋白、少量核酸)，+6、+4价的为可溶性无机硒盐(硒酸盐、亚硒酸盐)，在所述步骤(1)中，在富硒酵母的样品中加入强碱溶液(比如，氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液)，在一定温度下能有效的改变富硒酵母细胞壁结构，增强通透性，从而提高富硒酵母中无机硒的提取效果。此外，在所述步骤(3)中，通过将pH调至富硒酵母中蛋白质的等电点，可去除提取液中的可溶性硒蛋白，从而避免-2价硒对+4价硒含量测定的干扰(-2价硒对+4价硒含量测定的有微弱的干扰)。另外，在所述步骤(5)中，在加入盐酸并加热的条件下，能将富硒酵母的样品中+6价硒还原为+4价，从而通过氢化物原子荧光光谱法测定出无机硒含量。此外，本专利技术还公开了一种测定富硒酵母中有机硒的含量的方法，其技术方案如下：一种测定富硒酵母中有机硒的含量的方法，包括以下步骤：(a)测定富硒酵母中总硒的含量；(b)根据上述方法测定富硒酵母中无机硒的含量；(c)计算硒酵母中有机硒含量：计算富硒酵母中有机硒含量：将步骤(a)测得的硒酵母中总硒含量减去步骤(b)测得的富硒酵母中无机硒含量，所得的差值即为富硒酵母中有机硒含量。其中，在所述步骤(a)中，对于总硒含量的测定，可以采用本领域已知的测定方法。作为本专利技术所述测定富硒酵母中有机硒的含量的方法的优选实施方式，测定总硒含量的方法为GB/T13883-2008《饲料中硒的测定》中记载的“氢化物原子荧光光谱法(即，HG-AFS法)”，具体步骤如下：(1)称取富硒酵母，按照每克富硒酵母中加入7.5mL混合酸的比例，向富硒酵母中加入混合酸，消化过夜；其中，所述混合酸由硝酸和高氯酸组成，所述硝酸和高氯酸的体积比为4:1；(2)加热消化所得的溶液，至溶液中高氯酸冒烟；(3)冷却，加入2.5mL盐酸，继续加热至高氯酸冒烟，冷却；(4)将步骤(3)冷却后所得溶液移入50mL容量瓶，定容；(5)取20mL步骤(4)所得溶液至50mL容量瓶中，加入8mL盐酸和2mL浓度为200g/L的铁氰化钾溶液，用水稀释至刻度，得到上样液，再采用原子荧光光度计测定上样液中的总硒含量。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下有益效果：1、本专利技术所述的测定硒酵母中无机硒含量的方法通过碱热法(比如，用氢氧化钠加热提取的方法)提高了无机硒的提取率，并通过调节pH至蛋白质等电点减少了有机硒对于无机硒含量测定的干扰，从而提高了无机硒含量测定的准确度。2、本专利技术采用一般的酸碱试剂以及常见仪器，在一般实验室均可实现富硒酵母中无机硒和有机硒含量的测定；此外，本专利技术采用强碱溶液(比如，氢氧化钠溶液)提取富硒酵母中无机硒的浸提法提取速度快，用时短，测定时间过程不超过1小时。3、本专利技术所述的测定富硒酵母中无机硒的方法操作简单，精密度高，回收率好，在优化条件下，无机硒的检出限为0.0201μg/L，线性范围为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)称取富硒酵母，向富硒酵母中加入强碱溶液，超声，使富硒酵母溶解，再进行水浴加热；其中，所述富硒酵母的质量与强碱溶液中氢氧根离子的物质的量的比为1g：15～35mmol；(2)加热完后，进行冷却，再离心，取上清液；(3)调节步骤(2)所得上清液的酸度，至上清液的pH值为4～5，静置后过滤，得到滤液；(4)向步骤(3)所得滤液中加入6～12mol/L盐酸水溶液，煮沸后进行稀释，采用原子荧光光度计测定稀释所得溶液中的无机硒的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)称取富硒酵母，向富硒酵母中加入强碱溶液，超声，使富硒酵母溶解，再进行水浴加热；其中，所述富硒酵母的质量与强碱溶液中氢氧根离子的物质的量的比为1g：15～35mmol；(2)加热完后，进行冷却，再离心，取上清液；(3)调节步骤(2)所得上清液的酸度，至上清液的pH值为4～5，静置后过滤，得到滤液；(4)向步骤(3)所得滤液中加入6～12mol/L盐酸水溶液，煮沸后进行稀释，采用原子荧光光度计测定稀释所得溶液中的无机硒的含量。2.如权利要求1所述的测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：所述强碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的至少一种。3.如权利要求2所述的测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：所述强碱溶液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.15～0.35mol/L。4.如权利要求3所述的测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.25mol/L。5.如权利要求1所述的测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，水浴加热的温度为45～65℃。6.如权利要求5所述的测定富硒酵母中无机硒含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，水浴加热的温度为65℃。7.如权利要求5所述的测定富硒酵母中...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒绪刚，吴国杰，占峰，林羽，付志欢，梁月娟，邱桂雄，周新华，
申请(专利权)人：广州天科生物科技有限公司，仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：广东,44