一种南瓜多糖分离纯化的方法及所得组分的用途技术

本发明专利技术涉及采用热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分５０％乙醇沉淀物，７０％乙醇沉淀物和８０％乙醇沉淀物。其步骤是采用热水浸提获得南瓜水提液，有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液浓缩，除蛋白，经乙醇分级沉淀获得南瓜多糖的三种组分５０％乙醇沉淀物，７０％乙醇沉淀物和８０％乙醇沉淀物。本发明专利技术方法工艺简单，适宜工业化生产。经生物活性试验表明，三种多糖组分无毒副作用，多糖组分５０％乙醇沉淀物和７０％乙醇沉淀物能抑制大鼠胰岛β细胞的凋亡和保护损伤的大鼠胰岛β细胞，８０％乙醇沉淀物能抑制白血病细胞增殖，诱导其凋亡和分化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种糖类分离纯化的方法及所得组分的用途，具体讲是采用 热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离纯化得到南瓜多糖的三种 组分及这三种组分的用途。
技术介绍
南瓜是葫芦科植物，果实无毒，是药食两用植物。据《滇南本草》记载， 南瓜性温，味甘无毒，入脾、胃二经，能润肺益气、化痰排浓、驱虫解毒、 治咳止喘，疗肺痈与便泌，并有利尿美容等作用。科学研究实验证表明南 瓜富含多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素、淀粉、葫芦巴碱、纤维素、植 物油以及部分微量元素。南瓜具有补中益气，排毒，驱虫，降低血压、血脂 和胆固醇等功效，特别是对糖尿病有着非常好的疗效。近年来，国内外专家对南瓜多糖多有研究，人们通过对多糖的分离和纯化使得这一高分子聚合物 在生命科学领域的研究有了重大发展。传统的南瓜多糖的分离纯化技术是将 南瓜热水浸提，水提液用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解后，上清液经透析或 膜分离，然后^^縮干燥，粗多糖采用离子交换纤维素柱层析和葡聚糖凝胶等分子筛柱层析对其进行纯化得到两种多糖组分pp-i和pp-n。该技术的不足之处是分离纯化步骤复杂，所需分离介质成本较高。另外有研究表明南瓜多 糖有降低糖尿病小鼠的血糖的作用，但其降糖机制尚不清楚，因此南瓜多糖 的开发和用途是一个有待于进一步研究的新课题。
技术实现思路
南瓜作为一种药食两用植物，资源丰富，价格低廉；作为普通菜肴，受 到食用者青睐，作为长效、无毒、降血糖、调血脂药物或食疗剂，具有可进 一步开发利用的价值和研究前景。随着南瓜多糖在药理学功效日趋显现，本专利技术的目的旨在提供一种南瓜多糖分离纯化的方法。即采用热水溶解和乙醇 分级沉淀的分离纯化方法，从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分50%乙 醇沉淀物，70%乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物。本专利技术的另一 目的是提供上述分离纯化得到的三种组分50%乙醇沉淀物 和70%乙醇沉淀物在防治糖尿病的用途；80%乙醇沉淀物可作为一种潜在的 白血病化疗药物的用途。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现 一种南瓜多糖的分离纯化方法，其步骤是(1) 取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经0.38%亚硫酸氢钠溶液 浸泡60min后，取出冲洗干净，添加3倍重量的蒸馏水，在75 80'C水浴上， 搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时，过滤；(2) 将上述所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓縮液中加 入3倍体积的95%乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；(3) 取沉淀物以去离子水充分溶解，Sevag法除蛋白即水溶液中加入 1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4:1，振荡使其充分混匀， 然后3000rmin"的转速离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变 性蛋白。水溶液仍按上述方法反复去蛋白，共3次；(4) 水溶液浓縮后，加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量为50 %，，加 入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇， 丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分50%乙醇沉淀物；上 述50%乙醇溶液中再加入95 %乙醇，使溶液中乙醇含量为70%,，加入乙醇 后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮 依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分70%乙醇沉淀物；上述70% 乙醇溶液中再加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量为80%，，加入乙醇后静置 过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗 涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分80%乙醇沉淀物。50%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶 液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.24，多糖含量为11.9%，茚三酮反应颜色无明显变化，紫外光谱分析在260nm， 280nm处略有吸收，说明含有微量 蛋白质和核酸。70%乙醇沉淀物淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水 溶液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.26，多糖含量为19.7%，茚三酮反应 显紫色，紫外光谱分析在260nm， 280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和 核酸。80%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶 液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.31，多糖含量为22.5%，茚三酮反应显 紫色，紫外光谱分析在260nm， 280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和核 酸。本专利技术经分离纯化得到的南瓜多糖的三种组分50%乙醇沉淀物，70% 乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物，其用途分述如下本专利技术得到的南瓜多糖的分离组分50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物对 糖尿病的防治作用的研究主要通过MTT法测定大鼠胰岛P细胞存活率，光学显 微镜观察胰岛P细胞形态等实验，检测了南瓜多糖组分50%乙醇沉淀物和70 %乙醇沉淀物对大鼠胰岛P细胞的作用。本专利技术发现50%乙醇沉淀物和70%乙 醇沉淀物对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛I3细胞有一定的保护作用(见图l)，并能 抑制体外培养的大鼠胰岛I3细胞的凋亡(见图2)，由此说明南瓜多糖50%乙醇 沉淀物和70X乙醇沉淀物可能通过保护和修复损伤的胰岛p细胞对糖尿病有 一定的防治作用。本专利技术的南瓜多糖80%乙醇沉淀物对白血病潜在的治疗作用的研究主要 应用生长曲线测定法，检测不同浓度的80%乙醇沉淀物对人红白血病细胞株 K562细胞增殖的影响；用流式细胞仪检测药物对K562细胞凋亡的影响；根据 细胞形态、硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力来测定K562细胞分化。本专利技术发现 80X乙醇沉淀物能明显抑制K562细胞的增殖(见图3)，抑制作用呈时间和浓 度依赖性；并能诱导K562细胞凋亡和分化(见图4)，由此说明南瓜多糖80% 乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物。本专利技术的优点和产生的有益效果本专利技术的特点是分离纯化的操作步骤相对简单，所需分离介质成本低，适宜大规模工业化生产；南瓜多糖50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物对糖尿 病有一定的防治作用，80%乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物， 具备极高的药用前景。附图说明图1.南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对四氧嘧啶损伤 的大鼠胰岛P细胞的保护作用。图2.不同浓度的南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对大 鼠胰岛P细胞凋亡的保护作用。图3.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的抑制作用。图4.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞分化的作用。具体实施方式实施例1取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切成厚度为0.2—0.5,的南瓜片，放 入烧杯中，加入0.38。/。亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出南瓜片，冲洗干 净，放入三角瓶中，添加3倍重量的蒸馏水，在75 80 。C水浴上，用玻璃 棒搅拌提取3次，时间分别为6小时,4小时和4小时。提取后滤液用滤纸过 滤。将所得滤液合并后，倒入烧杯中。离心，取上清液用旋转蒸发仪真空浓 縮。滤液真空浓縮后，将浓縮液倒入烧杯中，在浓縮液中加入3倍体积的95 %乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物。取沉淀物以去 离子水充分溶解得到水溶液，倒入烧杯中。Sevag法除蛋白即在水溶液中 加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4: 1,振荡使其充分 混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种南瓜多糖的分离纯化方法，其特征在于：（１）．取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经０．３８％亚硫酸氢钠溶液浸泡６０ｍｉｎ后，取出冲洗干净，添加３倍重量的蒸馏水在７５～８０℃水浴上，搅拌提取３次，时间分别为６小时，４小时和４小时，过滤；（２）．将所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓缩液中加入３倍体积９５％乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；（３）．取沉淀物用去离子水充分溶解得到水溶液，Ｓｅｖａｇ法除蛋白：即在水溶液中加入１／２体积的氯仿和正丁醇混合溶液，氯仿∶正丁醇＝４∶１，振荡使其充分混匀，然后３０００ｒｍｉｎ↑［－１］离心１５ｍｉｎ，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变性蛋白；水溶液仍按此法反复去蛋白，共３次；（４）．水溶液浓缩后，加入９５％乙醇，使溶液中乙醇含量为５０％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用９５％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分５０％乙醇沉淀物；上述５０％乙醇溶液中再加入９５％乙醇，使溶液中乙醇含量为７０％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用９５％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分７０％乙醇沉淀物；上述７０％乙醇溶液中再加入９５％乙醇，使溶液中乙醇含量为８０％，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用９５％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分８０％乙醇沉淀物。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王锐，樊瀛哲，于烨，刘静，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]