一种富集检测磷酸化蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及材料分析化学和有机化学领域。本发明专利技术提供一种富集检测磷酸化蛋白的方法。该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物层的厚度为50‑100nm。本发明专利技术将该富集材料与分散固相萃取模式有机的结合可实现复杂混合物中磷酸化蛋白高选择性、高重复性和高通量地富集。

Method for enriching and detecting phosphorylated proteins

The present invention relates to the field of materials analysis, chemistry and organic chemistry. The present invention provides a method for enriching and detecting phosphorylated proteins. The method is to obtain a mixture of mixed protein phosphorylation and non phosphorylation after direct and enrichment materials mixed with dispersive solid phase extraction to separation and enrichment of non phosphorylated protein and phosphorylated protein, and the samples were chromatographic analysis, including the base material and formed on the surface of the substrate concentration of the two group divided into copolymer layer, the two-component polymer layer with a thickness of 50 100nm. The invention combines the enrichment material with the dispersed solid phase extraction mode to realize high selectivity, high repeatability and high throughput accumulation of phosphorylated proteins in complex mixtures.

【技术实现步骤摘要】
一种富集检测磷酸化蛋白的方法
本专利技术涉及材料分析化学和有机化学领域，尤其涉及一种富集检测磷酸化蛋白的方法。
技术介绍
蛋白质的磷酸化是一种可逆的翻译后修饰，在细胞的增殖、分化、信号传导以及转录与翻译、蛋白质复合体形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此，磷酸化蛋白成为了蛋白质组学研究的热点问题。天然样品中的磷酸化蛋白难以直接用于目前常用的质谱法检测。为解决该问题，改善质谱对磷酸化蛋白的信号响应，必须对磷酸化蛋白进行分离富集，这成为了磷酸化蛋白组学研究中的重要内容。目前由于完整磷酸化蛋白分离困难，磷酸化蛋白组学研究主要基于“自下而上”的策略，即先将蛋白无差别酶解成多肽链段，在肽段水平上鉴定其中的磷酸化位点，然后进行搜库、推理和拼接得到完整的磷酸化蛋白信息，这种方法虽然简单易行，但是所得蛋白水平的磷酸化信息离实际生物样品中的真实信息存在很大差距。因此，在蛋白水平上直接进行分离一直以来是磷酸化蛋白质组学研究者们所努力尝试但仍未解决的难题。
技术实现思路
本专利技术为解决上述技术问题提供了一种富集检测磷酸化蛋白的方法。该方法分离效率高，样品损失小，低成本。本专利技术采用下的技术方案如下：一种富集检测磷酸化蛋白的方法，该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如下：其中R为羧基，硝基，甲基，甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；所述双组分共聚物层的厚度为50-100nm。上述方案中，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。上述方案中，所述富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面所得到，具体过程如下：1)在烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-5:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:4-20；2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温70-90℃条件下进行原子转移自由基聚合反应12-36小时；3)反应结束后，洗涤基底表面并在60-80℃下真空干燥，得到所述富集材料。上述方案中，样品的上样量为富集材料与蛋白混合物的质量比例为400:1-2000:1，孵育温度为20-40℃。上述方案中，所述磷酸化蛋白为α-酪蛋白、β-酪蛋白或卵清蛋白，非磷酸化蛋白为牛血清蛋白。上述方案中，所述分散固相萃取模式的具体步骤如下：1)先采用活化液和平衡液活化及平衡富集材料，将该富集材料与蛋白混合物以质量比例为100:1-1000:1混合，孵化0.5分钟-60分钟；分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀，其中磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的质量比为1:1-1:50；2)采用pH＝0-7的有机溶液对沉淀清洗；3)将清洗后的沉淀采用pH3-7有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液；浓缩得到非磷酸化蛋白。4)将清洗后的沉淀采用体积pH0-3有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1-100:1，分散固相萃取分离，收集上层清液，得磷酸化蛋白，上述过程的操作温度为20-40℃。上述方案中，所述有机溶液、活化液和平衡液均为有机溶剂、有机酸和去离子水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂的体积浓度为10％-95％，有机酸的体积浓度为0.1％-5％。上述方案中，所述活化液中有机溶剂体积浓度为10-30％，pH＝5-7。上述方案中，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为30-70％，pH＝0-5。上述方案中，所述色谱分析的参数设置如下：1)采用C4、C8或者C18反向色谱柱，填料直径1-20μm，孔径10-100nm，柱内径2-10mm，长度50-1000mm；2)采用紫外或者二极管阵列检测器，检测波长范围为200-280nm；3)采用流动相为甲醇/水或者乙腈/水的混合物再加0.1-0.5％三氟乙酸，其中有机相的比例为0％-70％，流速为0.05-2.0ml/min。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术制备的富集材料在分离富集磷酸化蛋白时表现出了高选择性、高通量、低成本、分离效率高及样品损失小等特点，可以实现多磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的有效分离；2、本专利技术制备的富集材料可以直接通过离心模式分离材料与样品底物，操作简单，易于重复。特别适合微量生物样品中磷酸化蛋白的分离富集；3、本专利技术富集得到的磷酸化蛋白可通过配有普通紫外或者二极管阵列检测器的液相色谱检测，相比于天然生物样品直接用于质谱解析的方法，更加容易获得磷酸化蛋白的信号。附图说明图1为双组分聚合物分子结构示意图。图2为双组分聚合物接枝的硅胶样品结构示意图。图3为硫脲单体合成步骤示意图。图4为双组分聚合物表面(以硫脲单体末端R为羧基为例)对α酪蛋白和牛血清蛋白的石英微天平(QCM-D)吸附曲线(载液为10％乙腈+90％去离子水)。图5为双组分聚合物表面(以硫脲单体末端R为羧基为例)对α酪蛋白和牛血清蛋白的石英微天平(QCM-D)吸附曲线(载液为30％乙腈+70％去离子水)。图6为双组分聚合物表面原子力显微镜形貌图。图7为双组分聚合物表面浸泡牛血清蛋白后的原子力显微镜形貌图。图8为双组分聚合物表面浸泡α酪蛋白后的原子力显微镜形貌图。图9为富集应用实例中使用固定相结构示意图。图10为α-酪蛋白和牛血清蛋白标准蛋白纯样的色谱图。图11为α-酪蛋白和牛血清蛋白1:1混合物经富集材料分离后不同馏分中α-酪蛋白和牛血清蛋白色谱图。图12为α-酪蛋白和牛血清蛋白1:2混合物经富集材料分离后不同馏分中α-酪蛋白和牛血清蛋白色谱图。图13为α-酪蛋白和牛血清蛋白1:5混合物经富集材料分离后不同馏分中α-酪蛋白和牛血清蛋白色谱图。具体实施方式为使本专利技术的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本专利技术，这些实施例仅用于说明本专利技术，而本专利技术不仅限于以下实施例。实施例中所用原料及设备:HPLC柱色谱填料硅胶(氨基修饰)由上海月旭公司购得。溴化亚铜(CuBr，99.999％)，联吡啶类配体，有机碱，异丙基丙烯酰胺，丙烯酰氯，对氨基苯甲酸乙酯以及各种测试用蛋白由Sigma-Aldrich公司购得。丙酮，甲醇，二甲基甲酰胺(DMF)，甲酸由阿尔法公司购得。异丙基丙烯酰胺在使用前用正己烷重结晶三次，放置在真空干燥器中备用。其他试剂均使用市售分析纯。1Hspectra在BrukerARX300spectrometer检测获得。石英微天平(QCM)吸附数据由Q-SenseE4system检测获得。色谱分析结果由Waters2695HPLC结合Waters2998二极管阵列检测器检测获得。实施例1富集材料的制备双组份共聚物结构如图1所示，其中X＝0.01-0.5。以X＝0.2为例，在25ml三口烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集检测磷酸化蛋白的方法，其特征在于，该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种富集检测磷酸化蛋白的方法，其特征在于，该方法是将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的混合后得到的蛋白混合物直接与富集材料混合，采用分散固相萃取模式来分离富集非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白，并对样品进行色谱分析，所述富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如下：其中R为羧基，硝基，甲基，甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；所述双组分共聚物层的厚度为50-100nm。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe3O4、多孔SiO2、多孔Al2O3、多孔TiO2或多孔ZrO2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面所得到，具体过程如下：1)在烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-5:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:4-20；2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温70-90℃条件下进行原子转移自由基聚合反应12-36小时；3)反应结束后，洗涤基底表面并在60-80℃下真空干燥，得到所述富集材料。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品的上样量为富集材料与蛋白混合物的质量比例为400:1-2000:1，孵育温度为20-40℃。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化蛋白为α-酪蛋白、β-酪蛋白或卵清蛋白，非磷酸化蛋白为牛血清蛋白。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分散固相萃...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿光焱，孙涛垒，陆琦，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42