一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法，是将从储存环境取出的鲜冬虫夏草经前处理后切成1‑2mm薄片，然后在0.3％TTC溶液中避光恒温染色一定时间，漂洗干净，再将染色后的薄片切成碎片，用乙醇萃取，50‑60℃恒温至细胞变为无色，收集萃取液，在485nm处测定吸光度OD值。本方法通过鲜冬虫夏草体内细胞呼吸作用产生的脱氢酶定量检测其活力，方法简单易操作，结果稳定可靠，适合大规模推广使用。

Method for measuring freshness of fresh Cordyceps sinensis

The invention discloses a method for determining the freshness of fresh Cordyceps sinensis, is removed from the storage environment of fresh Cordyceps sinensis after preprocessing 2mm cut into 1 slices, and then in the 0.3%TTC solution to avoid light temperature dyeing time, rinse, and then dyed slices cut into pieces, with ethanol extraction, 50 60 constant temperature to the cell becomes colorless, collecting extracted liquid, determination of OD value in 485nm. The method detects the activity of the dehydrogenase produced by the respiration action of the fresh Cordyceps sinensis in vivo, and the method is simple, easy to operate, stable and reliable, and is suitable for large-scale popularization and use.

【技术实现步骤摘要】
一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法
本专利技术涉及一种中药材原材料的检测方法，具体地涉及一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法。技术背景冬虫夏草是高级滋补名贵中药材，传统上具有补肺益肾，化痰止咳的功效。现代研究表明，冬虫夏草还有很多方面功效，常用于恶性肿瘤的辅助治疗、降血压、降血脂、调节免疫功能等。刚采挖的鲜冬虫夏草最大程度的保留了营养成分，并且外观饱满、口感好，所以催生了近年的鲜冬虫夏草产品。鲜冬虫夏草在出土、清洗、灭菌、包装、储存的过程中，会对鲜度造成一定的损害。随着鲜冬虫夏草的鲜度降低，其营养和功效成分及外观、口感都会受到一定影响。因此，如何评判冬虫夏草的鲜度成为一个重要的研究课题。现有技术中对鲜品的鲜度一般通过感官评价，但是这种传统方法需要训练有素的专业鉴评人员，并且这些人员易受其健康状况、年龄、性别、性情、表达能力等多种因素的影响，鉴评结果往往主观性强、重复性差、并且容易出现感官疲劳，目前尚未见对冬虫夏草鲜度进行研究的报道，开发一种客观量化的方法来测定冬虫夏草的新鲜度十分必要。四氮唑法(TTC法)用于评价鲜品的活力在真菌类及植物类领域有报道，原理主要是细胞呼吸进行的脱氢酶作用，使脱下的氢氧化2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)还原生成红色的三苯基甲臜(TTF)，进行比色定量。但根据现有技术文献进行测定存在对专业操作技能要求较高且操作复杂、耗时较长的问题。如中国专利申请(CN104990881A)一种快速检测羊肚菌菌丝活力的办法，羊肚菌菌株需在特定培养基上23℃培养10d，再转至另一培养基中培养6d后进行TTC染色定量检测。也有不少文献将TTC法用于中药材超低温保存后的细胞相对活力的检测，但也存在操作复杂、耗时较长的问题。如文献《人参细胞TTC-脱氢酶活力测定条件的优化》，将人参叶片诱导而成的愈伤组织继代培养15d左右，接种于MS液体培养基中，置于摇床上25℃培养10d得人参细胞；且TTC染色反应时间需18h。以上技术文献除了操作复杂、耗时太长外，直接应用于冬虫夏草鲜度检测还存在重现性差，实验成本高，不能准确反映冬虫夏草鲜度等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法，该方法能够简单、快速、准确的判断鲜冬虫夏草的鲜度。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：a.将鲜冬虫夏草进行前处理后，切片，厚度为1～2mm；b.取步骤a中鲜冬虫夏草切片置于质量分数为0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液中，37℃恒温避光染色，染色后，在暗室中用蒸馏水洗涤切片；c.将步骤b染色后的切片破碎，用有机溶剂在避光、50-60℃恒温萃取至切片为白色，得到萃取液，即为供试品溶液；(2)对照品溶液制备：将质量分数为0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液与质量分数为0.1％连二亚硫酸钠以1:5的体积比混合反应生成三苯基甲臜，离心，沉淀部分用无水乙醇溶解得母液，取母液用无水乙醇配制不同浓度梯度的三苯基甲臜溶液，即为对照品溶液；(3)吸光光度值OD485测定：使用酶标仪在485nm波长处测步骤(1)、(2)中供试品溶液与对照品溶液的吸光值；(4)鲜度计算：根据步骤(3)中三苯基甲臜对照品的浓度与对应吸光值OD485，建立两者标准曲线方程；结合标准曲线方程和测定的供试品吸光度值计算供试品中三苯基甲臜的质量浓度c1，进而计算每克鲜冬虫夏草样品中表征其鲜度的脱氢酶活力X，X＝(c1*v)/m其中X表示样品中脱氢酶的活力，μg/g；c1表示根据标准曲线方程计算所得的供试品溶液中三苯基甲臜的浓度，μg/mL；m表示样品的质量，g；v表示萃取液的体积，mL。优选地，步骤(1)中所述前处理方法为：将整根鲜冬虫夏草浸泡于37℃的5％葡萄糖溶液中15min。优选地，步骤(1)所述切片部位为鲜冬虫夏草虫体头部起第4-7对足区段。更优选地，步骤(1)所述切片部位为鲜冬虫夏草虫体头部起第4-7对足区段的中间部位。优选地，步骤(1)所述染色的时间为2h。优选地，步骤(1)所述有机溶剂为无水乙醇。优选地，步骤(1)中鲜冬虫夏草切片与萃取用有机溶剂的质量体积比为1:25，g/mL。优选地，步骤(1)中萃取时间为20-30min。优选地，所述2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液用pH7.3-7.5的磷酸缓冲液溶解配制而成。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术对低温冷藏的鲜冬虫夏草进行了5％葡萄糖溶液恒温浸泡处理，最大限度的维持鲜冬虫夏草的活力，能够真实的反映储存环境中冬虫夏草的新鲜度。2.本专利技术在大量实验过程中发现，同一根鲜冬虫夏草的不同区段活力强弱不一致，其中虫体头部起第4-7对足区段为活力最强区段。选取这一区段为检测对象，既可避免实验材料的浪费又使结果真实、灵敏、可靠。3.本专利技术可以快速判断鲜冬虫夏草的鲜度，染色加萃取时间大大缩短，即3小时内就可以得到检测结果，大大节省了人力和时间成本。4.本专利技术所用的仪器常见且种类少，试剂用量少，实验成本低，步骤简单，没有复杂繁琐的过程，易于学习和操作，适用于大规模推广使用。附图说明图1是鲜冬虫夏草整体图，冬虫夏草虫体具有8对足，胸足3对，靠近头部，腹足4对，尾足1对，其中A是子座区段，B是虫体头部至第4对足区段，C是虫体头部起第4-7对足区段，D是虫体头部起第7对足至尾部区段。图2是实施例1中TTF浓度-吸光值OD485标准曲线图。具体实施方式下面结合附表和实施例对本专利技术作进一步说明：以下实施例中所述鲜冬虫夏草区段切片(子座区段，虫体头部至第4对足区段，虫体头部起第4-7对足区段，虫体头部起第7对足至尾部区段)都为该区段中间部分切片。实施例1考察不同前处理对鲜冬虫夏草鲜度的影响，具体步骤如下：(1)供试品溶液制备：a.将同一批次在-5℃～-10℃储存2个月左右的6根鲜冬虫夏草从储存环境中取出，分为2组(5％葡糖糖处理组和室温处理组)，每组3根。5％葡糖糖处理组放置于预热至37℃的5％葡萄糖溶液中37℃水浴处理15min，室温处理组为室温放置15min，然后将6根鲜冬虫夏草虫体部分从头部起第4-7对足区段进行均匀切片，厚度为1～2mm；b.分别取步骤a中6根鲜冬虫夏草切片0.2g，每3根相同处理为1组，共2个组，分别置于盛有质量分数为0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸缓冲液溶解配制而成)的6个烧杯中，37℃恒温水浴避光染色，染色2h后，取出鲜冬虫夏草切片，在暗室中用蒸馏水洗涤2～3次，洗涤之后用吸水纸去除切片表面的水分；c.将步骤b染色后的切片剪碎，用5mL无水乙醇在避光、50-60℃恒温、震荡水浴的条件下萃取20～30min，至切片为白色，得到萃取液，即为6个供试品溶液；(2)对照品溶液制备：将质量分数为0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸缓冲液溶解配制而成)0.2mL与质量分数为0.1％连二亚硫酸钠1mL混合反应生成三苯基甲臜，离心，弃去上清液，用无水乙醇溶解沉淀并定容至10mL，为母液，分别取母液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL比色管中，用无水乙醇定容，配制6个浓度梯度的三苯基甲臜溶液，即为对照品溶液；(3)吸光光度值OD485测定：使用酶标仪在485nm波长处测步骤(1)、(2)中6份供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：a.将鲜冬虫夏草进行前处理后，切片，厚度为1～2mm；b.取步骤a中鲜冬虫夏草切片置于质量分数为0.3％的2,3,5‑氯化三苯基四氮唑溶液中，37℃恒温避光染色，染色后，在暗室中用蒸馏水洗涤切片；c.将步骤b染色后的切片破碎，用有机溶剂在避光、50‑60℃恒温萃取至切片为白色，得到萃取液，即为供试品溶液；(2)对照品溶液制备：将质量分数为0.3％的2,3,5‑氯化三苯基四氮唑溶液与质量分数为0.1％连二亚硫酸钠以1:5的体积比混合反应生成三苯基甲臜，离心，沉淀部分用无水乙醇溶解得母液，取母液用无水乙醇配制不同浓度梯度的三苯基甲臜溶液，即为对照品溶液；(3)吸光光度值OD

【技术特征摘要】
1.一种鲜冬虫夏草鲜度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：a.将鲜冬虫夏草进行前处理后，切片，厚度为1～2mm；b.取步骤a中鲜冬虫夏草切片置于质量分数为0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液中，37℃恒温避光染色，染色后，在暗室中用蒸馏水洗涤切片；c.将步骤b染色后的切片破碎，用有机溶剂在避光、50-60℃恒温萃取至切片为白色，得到萃取液，即为供试品溶液；(2)对照品溶液制备：将质量分数为0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液与质量分数为0.1％连二亚硫酸钠以1:5的体积比混合反应生成三苯基甲臜，离心，沉淀部分用无水乙醇溶解得母液，取母液用无水乙醇配制不同浓度梯度的三苯基甲臜溶液，即为对照品溶液；(3)吸光光度值OD485测定：使用酶标仪在485nm波长处测步骤(1)、(2)中供试品溶液与对照品溶液的吸光值；(4)鲜度计算：根据步骤(3)中三苯基甲臜对照品的浓度与对应吸光值OD485，建立两者标准曲线方程；结合标准曲线方程和测定的供试品吸光度值计算供试品中三苯基甲臜的质量浓度c1，进而计算每克鲜冬虫夏草样品中表征其鲜度的脱氢酶活力X，X＝(c1*v)/m；其中X表示样品中脱氢酶的活力，μg/g；c1表示根据标准曲线方程计算所得的供...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾中，徐香琴，钱正明，李文佳，李文庆，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，宜昌山城水都冬虫夏草有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44