乳猪胸腺蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及的是具有促进细胞增殖效应的动物胸腺蛋白，尤其是具有促进细胞增殖效应的乳猪胸腺蛋白，以及它们的制作方法和用途。本发明专利技术主要是利用包括离心分离，透析的方法，从乳猪胸腺中制取一组具有促进细胞增殖的能力、可明显促进内皮细胞、成纤细胞生长的中分子量乳猪胸腺蛋白。本发明专利技术还有一个目的是利用这种中分子量乳猪胸腺蛋白所具有的促进细胞增殖的能力，作为化妆品的主要成分之一，可有效的促进人体表皮细胞的增殖和代谢，从而达到美容或类似的目的。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是具有促进细胞增殖效应的动物胸腺蛋白，尤其是具有促进细胞增殖效应的乳猪胸腺蛋白，以及它们的制作方法和用途。胸腺是一个分泌激素和产生多种细胞因子的免疫器官，由胸腺产生的一族多肽和蛋白质能控制调节着免疫反应的质和量。近年，国外对胸腺提取物的研究已引起重视。受胸腺活性物质能影响角膜及淋巴结上皮细胞增殖研究的启发，我们从乳猪胸腺中提取出一组中分子量水溶性蛋白质，简称胸腺蛋白，并对其进行促细胞增殖活性的研究。1972年，Goldstein等人成功地从小牛胸腺中分离到一组能调节免疫系统的多肽，命名为胸腺肽F5，生化分析表明，胸腺F5是具有活性的单一肽类，均为小分子肽类成份，分子量均小于15000道尔顿，但Goldstein报道的方法中，需要有超高速离心，丙酮沉淀等过程，工艺复杂，很难推广使用。1975年，Hooper等人在小牛胸腺肽的制备中第一次采用超滤技术，通过截留分子量小于15000道尔顿的胸腺肽组份来制备制剂，简化了提纯方法。在这几年中，许多人对小牛胸腺肽的进一步分离有生物活性的单肽类作了大量的工作，从胸腺肽组织中分离的具有免疫活性成分的分子量如下表 从上述内容可以看出，目前已经公开的研究结果，主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于15000道尔顿，还有的学者认为，胸腺中具有生物活性的成份均是分子量在6000道尔顿以下的较小的多肽。不难看出，目前所提取的胸腺肽主要是小分子量的，而且工艺条件复杂。有时还需要通过Sephader-150柱层纯化，也有人采用生理盐水浸提，冻融后经透析而成。本专利技术的主要目的是利用包括离心分离，透析的方法，从乳猪胸腺中制取一组中分子量的乳猪胸腺蛋白。本专利技术的另一目的是提供一种简单的方法，从而能有效的，可满足实际需要的来生产这种中分子量的乳猪胸腺蛋白。本专利技术的再一个目的是利用上述中分子量的乳猪胸腺蛋白，并利用这种中分子量的乳猪胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促进细胞增殖的能力，可明显促进内皮细胞，成纤细胞的生长。本专利技术还有一个目的，是利用这种中分子量乳猪的胸腺蛋白所具有的促进细胞增殖的能力，作为化状品的主要成份之一，可有效的促进人体表皮细胞的增殖和代谢，从而达到美容或类似的目的。下面具体描述本专利技术所述的中分子量的乳猪胸腺蛋白的制备工艺。首先，选用40-60天猪龄的健康乳猪的胸腺，拔除胸腺上的脂肪组织，将胸腺高速捣碎，所要注意的是，应在尽可能短的时间内完成这些工作，在此期间，匀浆属低温高速捣碎，将捣碎后的匀浆加温，温度保持在80-90℃之间，时间为10-30分钟，然后，离心分离，离心分离后去沉淀，留上清液，进行透析，所述的透析可以采用透析器，透析膜，也可以是其它能达到此目的的透析用具，透析膜或透析器的截留分子量为5万，然后再用截留分子量为3万的透析装置进行第二次透析，将二次透析的液体进行浓缩，再经过常规手段的处理，如除菌、分装，冻干，最后就得到了分子量在3-5万道尔顿的中分子胸腺蛋白。上述实例是用来说明本专利技术工艺，而不是用来限制本专利技术，类似的方法都在本专利技术的范畴之内。附图说明图1是不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)的增殖状况。图2是不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对小鼠3T3成纤维细胞(FC)的增殖状况。图3是乳猪胸腺蛋白(TP)、成猪胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)对内皮细胞的增殖效应。图4是乳猪胸腺蛋白(TP)、成猪胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)对成纤维细胞的增殖效应。图3、图4中1是乳猪胸腺蛋白(TP)、2是成猪胸腺蛋白(TP)、3是胸腺肽注射液(TF)、4是肝细胞生长素注射液(HGF)。将上述方法制备的中分子胸腺蛋白进行各次试验，具体内容如下。样品包括本专利技术中分子量的乳猪胸腺蛋白(TP)，分子量3-5万。胸腺肽注射液(TF)，由广东省生物制品研究所提供。促肝细胞生长素注射液由广东省阳江制药厂提供。内皮细胞(EC)的制备取健康产妇分娩后3小时内的脐带，用D-Hanks′液反复冲洗脐静脉至无血迹，灌入0.25%胰蛋白酶5ML，置37℃水浴内10分钟，收集消化液，用5ml含20%小牛血清的1640培养液冲洗脐静脉，收集冲洗液，将消化液及冲洗液合并收入离心管内，1000rpm，离心10分钟，去上清。加入内皮细胞培养液(内含20%小牛血清，200u/ml青霉素，0.2ug/ml链霉素，200ug/mlECGS)稀释沉淀细胞，将细胞接种于玻璃培养瓶内，置50%CO2，37℃细胞培养箱内培养，每2-3天换液一次。直至细胞单层形成，即进行传代培养。传代培养时，用D-Hanks′液轻洗细胞单层2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室温下消化1-2分钟，弃消化液，加入内皮细胞培养液，并用吸管吹打20-30次，制成细胞悬液。以1∶2-3比率传代。用于实验的为2-3代细胞，经V因子相关抗原(VR.Ag)的抗体检测，确认为血管内皮细胞后方作为生物效应测定用细胞。小鼠3T3成纤维细胞(FC)由第一军医大学珠江医院提供(培养基为1640培养基加20%小牛血清)。本专利技术的乳猪胸腺蛋白生物效应测定每次取24孔塑料细胞培养板3块，于每个培养孔内(面积2cm)加入2X10个细胞，内皮细胞或成纤维细胞各72孔，将各检测样品(乳猪胸腺蛋白、成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)，按不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)分别加入3孔细胞中平行检测。每份样品设立3孔空白对照(与盐水做对照)。将上述细胞置5%CO2，37℃细胞培养箱内静置培养72小时，收获细胞，台盼蓝染色，计数每孔内活细胞数。计数方法为置显微镜下每孔随机计数5个高倍视野下的细胞数，取其均值，按下列等式换算成每平方厘米培养出的细胞数。ECs/cm＝细胞计数均值/0.19625x100，数据经统计学处理。不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖状况见图1.图2。图1、图2提示，本专利技术的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)均有明显的促增殖生物效应，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，而且增殖效应与乳猪胸腺蛋白(TP)的最佳浓度有关(0.2mg-0.4mg/ml)。各种不同检测样品对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖效应的影响比较，结果见图3，图4。图3、图4提示1.本专利技术的乳猪胸腺蛋白(TP)有明显促进内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖的作用。2.成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、促肝细胞生长素注射液(HGF)三种被检样品均无明显促内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖活性，与对照组比较无明显差异(P＞0.05)。3.促肝细胞生长素注射液(HGF)对内皮细胞(EC)虽然有低水平的刺激现象，但与乳猪胸腺蛋白(TP)相比仍有显著性差异，与成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)结果比较无明显意义。说明乳猪胸腺蛋白(TP)中确存在着一组能提高内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖的活性组份。自1966年Goldstein等首先研究小牛胸腺的丙酮提取物，1975年进一步用硫酸铵划分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中分子量乳猪胸腺蛋白，其特征在于本专利技术所述的中分子量乳猪胸腺蛋白（ＴＰ）经高效液相色谱分析共有６个组份峰、６条电泳带，紫外扫描在波长２８０ｎｍ中有一主要吸收峰，本专利技术所述的中分子量乳猪胸腺蛋白（ＴＰ）的分子量在３－５万道尔顿之间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光明，杨富强，谢汝锦，邵岩，张宜俊，
申请(专利权)人：通化欣洛维药业有限公司，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]