一种多孔磁性铜离子金属螯合载体及其制备方法、利用载体固定化木瓜酶的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种多孔磁性铜离子金属螯合载体及其制备方法，还有利用多孔磁性铜离子金属螯合载体固定化木瓜酶的方法，以及固定化木瓜酶在大豆分离蛋白水解中的应用，其中所述载体为以壳聚糖粉末为原料，Fe

【技术实现步骤摘要】
一种多孔磁性铜离子金属螯合载体及其制备方法、利用载体固定化木瓜酶的方法及其应用
本专利技术属于化学
，特别涉及一种多孔磁性铜离子金属螯合载体及利用该载体固定化酶。
技术介绍
磁性载体是最近几年迅速发展起来的用于固定化酶的新型材料载体。以其作载体的各种生物检测技术已经渗透到免疫学、微生物学、生物化学、分子遗传学、电化学以及酿酒发酵工业等各个领域，展现出广阔的应用前景。它是指通过适当方法使有机高分子与磁性材料相结合所形成的具有一定磁性和特殊结构的微球载体。与非磁性材料相比，其具有一些新的优点：(1)磁性材料制得的固定化酶可通过外加磁场来控制其在底物中的运动方向和方式，进一步提高催化效率；(2)能进行连续反应，可用于大规模生产；(3)便于与产物分离，简化提纯工艺，降低生产成本；(4)固定化酶可以回收重复利用。固定化金属亲和层析(Immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)是利用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸-组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，可以与一些过渡态的金属离子Cu2+、Zn2+等以配位作用的原理形成稳定的螯合物，从而可以对蛋白质进行分离、纯化。金属螯合载体和蛋白质通过过渡金属离子形成配位键结合，与传统固定化载体和方法相比，其结合牢固，不易被洗脱，结合位点少，可以实现酶的定向固定，不使用交联剂，避免了对酶分子造成的化学损伤，很大程度上保持了酶分子的天然构象，有效减少酶活的损失。金属螯合载体对固定到表面的蛋白质构象影响较小，若将这种技术应用于固定化酶，有望克服目前常用固定化酶载体和方法的一些不足。大豆分离蛋白常作为一种食品添加剂应用到食品工业中，是以低温脱溶大豆粕为原料生产的。其营养丰富，不含胆固醇，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一。蛋白质是人体必不可缺少的营养元素，在人体的生长和代谢过程中起着非常重要的作用。然而由于不同蛋白质的氨基酸组成与空间结构不同，在人体内的消化吸收率也大不相同。当蛋白质被水解为小肽和游离氨基酸后，其吸收利用率可以增加。但目前尚没有稳定合适的载体来固定化酶，在大豆蛋白的分离水解中达到很好的反映效果。
技术实现思路
本专利技术针对以上缺点，提供了一种环氧基密度高，结构合理的磁性载体，以达到利用该载体固定化酶，酶的催化效率高的目的。为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案来实现：本专利技术提供一种多孔磁性铜离子金属螯合载体，所述载体为以壳聚糖粉末为原料，Fe3O4作为磁性材料，SiO2为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；多孔磁性壳聚糖微球以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备的得到多孔磁性铜离子金属螯合载体。本专利技术还提供一种多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备方法，所述方法以壳聚糖粉末为原料，Fe3O4作为磁性材料，SiO2为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；然后，以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备得到多孔磁性铜离子金属螯合载体。进一步，所述制备方法包括以下步骤：步骤a，多孔磁性壳聚糖微球载体的制备，向壳聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室温下缓慢搅拌至壳聚糖完全溶解后；加入纳米Fe3O4，搅拌至均匀，加入致孔剂SiO2，搅拌几分钟后，加入液体石蜡，搅拌后升温至50℃，滴加Span80作为乳化剂，乳化至形成壳聚糖液滴，随后升温70℃至温度恒定，调节溶液pH值为9-11，保持为碱性，缓慢的逐滴滴加环氧氯丙烷进行反应；反应后对产物进行洗涤，直至pH值为中性，然后加入NaOH的溶液，80℃的加热2h，停止加热后，反复使用蒸馏水进行洗涤，再用稀盐酸洗涤一次，最后蒸馏水洗至中性，得到多孔磁性壳聚糖微球载体，烘干后备用；步骤b，多孔磁性壳聚糖微球载体的活化，向步骤a中制得的多孔磁性壳聚糖微球中，加入NaOH溶液和环氧氯丙烷，以及二甲亚砜和硼氢化钠，在40℃恒温反应4h；活化反应后，用去离子水洗涤，去除未反应的环氧氯丙烷和氢氧化钠；步骤c，多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备，向活化好的多孔磁性壳聚糖微球载体中，加入Na2CO3溶液，再加入亚氨基二乙酸，40℃恒温反应10h；然后将反应产物分散于CuCl2溶液中，25℃恒温反应24h，得到多孔磁性铜离子金属螯合载体。进一步，步骤a中乙酸溶液的质量分数为4％。进一步，步骤b中二甲基亚砜的体积分数为6％。进一步，步骤b中氢氧化钠溶液的浓度为0.6mol/L。进一步，步骤b中环氧氯丙烷的体积分数为45％。本专利技术还提供一种利用多孔磁性铜离子金属螯合载体固定化木瓜酶的方法，向多孔磁性铜离子金属螯合载体中，加入木瓜蛋白酶溶液，室温下振荡3h，用PBS洗涤数次至上清中检测不到酶活，得到固定化的木瓜蛋白酶。本专利技术还提供一种利用上述方法制得的固定化木瓜酶在大豆分离蛋白水解中的应用。进一步，所述应用为将大豆分离蛋白溶于水中，形成底物浓度为4％的水分散液，在80℃水浴锅中保温20min。迅速冷却至酶解温度，搅拌30min，调节pH至8，按底物比例加入6000-9000U/g的固定化木瓜蛋白酶，缓慢搅拌反应至少4h。总之，本专利技术的有益效果为：本专利技术的载体结构稳定，利用此载体制得的固定化酶催化效率高，还可用于大规模生产，制得的固定化酶可以回收重复利用，大大降低生产成本，同时本专利技术利用该载体制得的固定化木瓜酶在大豆蛋白的分离水解中效果很好。附图说明图1是二甲基亚砜对环氧基密度的影响。图2是反应温度对环氧基密度的影响。图3是反应时间对环氧基密度的影响。图4是环氧氯丙烷体积分数对环氧基密度的影响。图5是NaOH溶液浓度对环氧基密度的影响。图6是温度对木瓜蛋白酶固定化的影响。图7是给酶量对木瓜蛋白酶固定化的影响。图8是pH对木瓜蛋白酶固定化的影响。图9是固定化时间对酶固定化的影响。图10是温度对水解度的影响。图11是pH对水解度的影响。图12是时间对水解度的影响。图13是底物浓度对水解度的影响。图14是给酶量对水解度的影响。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细描述。一、多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备1.多孔磁性壳聚糖微球载体(PCMM)的制备称取1g的壳聚糖粉末于250mL的四颈瓶中，加入25mL的质量分数为4％的乙酸溶液，室温下缓慢搅拌至壳聚糖完全溶解后，加入0.3g纳米Fe3O4，搅拌至均匀，加入致孔剂Si02，搅拌几分钟后，加入100mL的液体石蜡，打开搅拌器(300r/min)，搅拌一段时间后升温至50℃，滴加几滴Span80作为乳化剂，乳化一定的时间，直至形成细小的壳聚糖液滴，随后升温70℃至温度恒定，滴加2mol/L的NaOH溶液，使溶液pH调至9-11的范围，保持为碱性，缓慢的逐滴滴加4mL的环氧氯丙烷(ECH)。反应5h后，停止反应，待温度冷却到室温，再依次用石油醚、无水乙醇、丙酮洗涤多次，最后用蒸馏水反复洗至pH值为中性。加入适量的质量分数10％NaOH的溶液，放入80℃的水浴锅中，加热2h，停止加热后，反复使用蒸馏水进行洗涤，再用适量的稀盐酸洗涤一次，最后蒸馏水洗至中性。将制得的多孔磁性壳聚糖微球(PCMM)放于50℃的真空干燥箱中至恒重、备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多孔磁性铜离子金属螯合载体，其特征在于，所述载体为以壳聚糖粉末为原料，Fe

【技术特征摘要】
1.一种多孔磁性铜离子金属螯合载体，其特征在于，所述载体为以壳聚糖粉末为原料，Fe3O4作为磁性材料，SiO2为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；多孔磁性壳聚糖微球以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备的得到多孔磁性铜离子金属螯合载体。2.一种多孔磁性铜离子金属螯合载体的制备方法，其特征在于，所述方法以壳聚糖粉末为原料，Fe3O4作为磁性材料，SiO2为致孔剂，环氧氯丙烷为交联剂进行反应，合成多孔磁性壳聚糖微球；然后，以环氧氯丙烷为活化剂，以亚氨基二乙酸为螯合配基，再与过渡态的金属铜离子进行螯合，制备得到多孔磁性铜离子金属螯合载体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤a，多孔磁性壳聚糖微球载体的制备，向壳聚糖粉末中，加入乙酸溶液，室温下缓慢搅拌至壳聚糖完全溶解后；加入纳米Fe3O4，搅拌至均匀，加入致孔剂SiO2，搅拌几分钟后，加入液体石蜡脱拌后升温至50℃，滴加Span80作为乳化剂，乳化至形成壳聚糖液滴，随后升温70℃至温度恒定，调节溶液pH值为9-11，保持为碱性，缓慢的逐滴滴加环氧氯丙烷进行反应；反应后对产物进行洗涤，直至pH值为中性，然后加入NaOH的溶液，80℃的水浴锅加热2h，停止加热后，反复使用蒸馏水进行洗涤，再用稀盐酸洗涤一次，最后蒸馏水洗至中性，得到多孔磁性壳聚糖微球载体，烘干后备用；步骤b，多孔磁性壳聚糖微球载体的活化，向步骤a中制得...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊春华，谷艳杰，李艳莉，张佳薇，曹彦美，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33