一种红细胞膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种红细胞膜及其制备方法和应用。本发明专利技术通过反复冻融法，并进一步结合匀浆破碎法和滤膜过滤，可以制备得到一种粒径均匀分布并且具有良好的抗原性、特别是具有良好的稀有血型系统抗原性的红细胞膜，解决了现有技术中红细胞膜通常只具有ABO血型抗原而不具备稀有血型抗原性的问题，同时还解决了现有红细胞膜粒径分布不均匀的问题，提供了一种粒径分布均匀并且具有全血型系统抗原性的红细胞膜，可以用于意外抗体的筛查和鉴定，保证了输血安全。

【技术实现步骤摘要】
一种红细胞膜及其制备方法和应用
本专利技术属于医学与生物学
，涉及红细胞膜的制备，具体地涉及一种红细胞膜及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞膜的主要成分为蛋白质(约49％重量比)、脂类(约44％重量比，主要有磷脂、胆固醇、糖脂等)和糖类，具有重要的生物学功能，与物质代谢、能量转换、细胞识别、细胞免疫、肿瘤发生等均高度相关，在分子生物学、细胞生物学、免疫学以及临床医学检测等领域均有广泛的研究以及应用价值。对于人体而言，红细胞的数量大、取材容易，并且人体成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，在因细胞内外渗透压不平衡而导致细胞膨胀破裂、胞浆外漏(即医学上所称的溶血现象)时，遗留的红细胞膜中无细胞器膜等杂质干扰，因此红细胞膜是最适于作为研究细胞膜的材料。现已证明，红细胞膜具有血型抗原活性，可与相应血型抗体反应，从而在红细胞血型鉴定中发挥重要作用，这也是目前对于红细胞膜研究的最重要应用；Siegel在1981年提出“红细胞免疫系统”的概念之后，现已公认红细胞膜蛋白亦具有免疫调节功能，在体内可发挥红细胞免疫功能，结合循环免疫复合物，并可调节T淋巴细胞及B淋巴细胞的功能；CN101327317B发现同物种的红细胞膜蛋白在具有相应血型抗体的人体内具有很好的杀瘤效应，并公开了一种由人红细胞膜蛋白和缓冲液组成的治疗肿瘤的注射液，等等。不难看出，前述相关领域的研究，均须建立在获得具有抗原性的红细胞膜的基础上进行。现有技术中红细胞膜的制备主要是通过低渗溶解红细胞，高速离心洗涤去除血红蛋白后用等渗的盐水或PBS重悬。CN101109755A公开一种红细胞膜处理的方法，包括加预冷的0.01mol/LTric-HCl与红细胞混合，4℃放置2h，再离心20min至无肉眼可见的红细胞为止。肖毅等(两种提取红细胞膜蛋白方法的比较，细胞与分子免疫学杂志，1997(2)：44-45)比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法，其中一种是沉淀物加入预冷蒸馏水，离心后，因沉淀物中仍有少量红细胞，加入0.01N冰醋酸，置4℃2h后离心，沉淀物加NS混匀后，再加0.1NNaOH，室温30min，离心弃上清后加NS，用0.1NHCl(约0.1ml)调pH至7.4。现有提取红细胞膜的方法通常采用有机溶剂，容易破坏细胞膜表面结构，极易丧失抗原性，特别是丧失稀有血型系统(ABO血型系统以外的其他血型系统)的抗原性，这将导致无法进行不规则抗体(意外抗体)的筛查，极大地增加了输血风险；同时现有方法提取的红细胞膜通常存在粒径分布不均匀的问题。为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种粒径分布均匀并且具有良好抗原性(特别是稀有血型系统抗原性)的红细胞膜，以及其制备方法和应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种红细胞膜，该红细胞膜表面具有稀有血型抗原性，解决了现有红细胞膜通常仅具有ABO血型抗原性而不具备稀有血型抗原性的问题。本专利技术的另一个目的在于提供一种粒径分布均匀的红细胞膜。本专利技术的同时提供所述红细胞膜的制备方法。本专利技术的再一个目的在于提供上述红细胞膜在血型抗体检测和鉴定
的应用，其可以用于意外抗体的筛查和鉴定。本专利技术的一方面提供了一种红细胞膜，其具有良好的稀有血型抗原性，且粒径分布均匀。本专利技术所述的一种红细胞膜，由如下方法制备而成：(1)取压积红细胞，加入生理盐水于－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化；(2)离心，去上清，洗涤，得到的白色的沉淀物。优选的，所述的步骤(1)中所述压积红细胞与生理盐水加入量按体积比优选为2:1-1:10，更优选为1:1-1:5，最优选为1:1。所述冰冻的温度越低越好，以达到快速冻实的目的，在具体实施例中优选为－20℃-－200℃，更优选为－40℃-－196℃，最优选为－80℃-－196℃。所述融化的温度优选为25℃-37℃，最优选为37℃；所述融化优选在水浴箱中进行。优选的，所述的步骤(1)重复2-10次，更优选为3-8次，最优选为3次。优选的，所述的步骤(2)之后还包括步骤(3)将沉淀物进行匀浆破碎，匀浆时间为5-80min。匀浆时间更优选为10-40min，最优选为20min。优选的，所述的步骤(2)中离心的离心力优选为5000-20000g，更优选为10000-18000g，最优选为15000g；离心时间优选为10-30min，更优选为15-25min，最优选为20min。所述的洗涤次数优选为2-10次，更优选为3-8次，最优选为5次。进一步优选的，所述的步骤(3)之后还包括步骤(4)采用均一孔径的滤膜进行过滤。所述滤膜的孔径优选为1-20μm，更优选为2.5-10μm，最优选为5μm。本专利技术的另一方面提供了一种红细胞膜的制备方法，具体方法如前所述。在本专利技术的优选实施方式中，提供一种红细胞膜的制备方法，包括：(1)取压积红细胞，加入等量的生理盐水后于－20℃-－200℃冰冻，冻实取出于20℃-40℃融化；如此反复2-10次后5000-20000g离心10-30min，去上清，加入纯水洗涤2-10次，得到白色沉淀物；(2)利用匀浆器对提取的红细胞膜进行匀浆破碎5-80min；(3)用滤膜进行过滤，得到粒径均匀分布的红细胞膜。在本专利技术的具体实施方式中，对于制备得到的红细胞膜还进行蛋白浓度测定以及抗原性验证。所述蛋白浓度测定的方法包括但不限于紫外分光光度法、Lowry(酚试剂)法，考马氏亮蓝染色法、BCA(Bicinchoninicacid)法，胶体金法等，优选为BCA法和胶体金法，最优选为BCA法。所述抗原性验证的方法优选采用凝集抑制试验。用现有方法提取的红细胞膜通常仅能够保留ABO血型系统的抗原性，而本专利技术不仅能够验证ABO血型系统的抗原性，还可以验证稀有血型系统的抗原性。所述的稀有血型系统包括但不限于Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统等。所述抗原性验证的方法包括：首先检测已知稀有血清的抗体效价，然后取等量校正浓度的抗体分别加入等体积的红细胞膜和生理盐水，室温放置后离心，取上清，加卡，观察凝集强度。所述校正浓度的抗体的体积优选为10-100ul，更优选为20-80ul，最优选为50ul。所述红细胞膜和生理盐水的体积优选为10-100ul，更优选为20-80ul，最优选为50ul。所述室温放置的时间优选为3-30min，更优选为5-20min，最优选为10min。所述离心的离心力优选为500-3000g，更优选为800-2000g，最优选为1000g；离心时间优选为20-300s，更优选为30-120s，最优选为60s。本专利技术的又一个方面提供了上述红细胞膜在血型抗体检测和鉴定
的应用。优选的，所述的血型抗体选自Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统。优选的，所述红细胞膜可以用于意外抗体的筛查和鉴定。本专利技术所述的红细胞膜是指红细胞处理后的红细胞膜样品或红细胞膜提取物，其保留了对于血型抗体的抗原性。本专利技术通过反复冻融法，并进一步结合匀浆破碎法和滤膜过滤，可以制备得到一种粒径均匀分布并且具有良好的抗原性、特别是具有良好的稀有血型系统抗原性的红细胞膜，解决本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取压积红细胞，加入生理盐水于－20℃‑－200℃冰冻，再于20℃‑40℃融化；(2)离心，去上清，洗涤，得到沉淀物。

【技术特征摘要】
1.一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取压积红细胞，加入生理盐水于－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化；(2)离心，去上清，洗涤，得到沉淀物。2.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述压积红细胞与生理盐水加入量按体积比优选为2:1-1:10。3.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述冰冻的温度为－40℃-－196℃；所述融化的温度为25℃-37℃。4.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化的过程重复2-10次。5.权利要求1所述的一种红细...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪德清，杨璐，于洋，马春娅，
申请(专利权)人：汪德清，
类型：发明
国别省市：北京,11