本发明专利技术公开了一种血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用，所述的检测包括(1)将血型红细胞膜抗原包被至载体；(2)使检测样品与包被至载体的抗原接触；(3)加入标记有标记物的二抗；(4)针对标记物进行信号检测。本发明专利技术所述血型抗原芯片和红细胞意外抗体检测方法灵敏度高、准确性好、不依赖于红细胞，且能对众多稀有血型抗原的结合抗体进行检测。
A blood type antigen chip and its application in the detection of red blood cell accidental antibody
The invention discloses a blood type antigen chip and its application in the detection of red blood cells in the detection of unexpected antibodies, including the (1) blood group of erythrocyte membrane antigen to the carrier; (2) the test sample and coated antigen carrier to contact; (3) adding labeled marker two resistance; (4) signal detection for marker. The blood group antigen chip and the red blood cell accident detection method of the invention have high sensitivity, good accuracy and no reliance on red blood cells, and can detect the binding antibodies of many rare blood group antigens.
【技术实现步骤摘要】
一种血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及血型抗体的血清学检测技术，特别是涉及一种血型抗原芯片、其制备方法及在红细胞意外抗体检测中的应用。
技术介绍
输血安全已成为医疗卫生工作中的一个重要问题，并引起全社会的高度关注。世界卫生组织(WHO)一贯重视输血安全工作，近年来进一步加强了血液安全工作的力度，血液安全已被WHO列为了全球卫生工作七项重点工作之一。输血安全问题包括传染性输血不良反应的问题和非传染性输血不良反应的问题。英国、美国、法国均启动了输血严重危害报告系统，用来收集和报告各所医院自愿报告的与血液成分输注相关的主要不良事件。从欧美国家统计的数据可以看出，非传染性输血不良反应的发生率很高，并且一旦发生，后果极其严重。红细胞同种意外抗体在中国汉族患者中检出率为0.38％-2.38％，是引起非传染性输血不良反应、新生儿溶血病、血型鉴定困难以及疑难配型、不明原因的贫血、红细胞输注无效等的主要原因。输血前进行红细胞同种不规则血型抗体精准检定，对于输血安全和输血疗效至关重要。为确保输血安全和输血疗效，红细胞同种意外抗体检测已成为输血前常规检测项目。若患者体内存在红细胞意外抗体，一旦输入的献血员红细胞上存在相应抗原，即会发生溶血性输血不良反应，严重者甚至死亡。由于用来免疫生成单克隆抗体的抗原的精确结构是未知的，来源于多种异体材料包括卵巢囊液及唾液糖蛋白的可溶性抗原和人类细胞，因此为了减少由于抗原变异导致漏检的风险，这些用于常规血清学检测的克隆株反应较广泛，这同样增加了结构相似的抗原之间的交叉反应风险。有文章报道，ABO单克隆抗体与非ABO抗原的交叉反应尽管在血清学反应中很少出现，但经常出现于非血清学反应如酶免疫分析法和抑制试验中，因此抗体应用于此类试验时必须考虑交叉反应的情况。常规血清学试验检测灵敏度较低，容易导致献血员弱抗原的漏检，输注至患者体内引起溶血性输血不良反应，威胁患者生命，应用灵敏度较高的非血清学试验检测献血员血型抗原已成为发展趋势，若使用特异性不强的稀有血型抗体试剂进行献血员血型抗原分型可能导致错误的分型结果，进而无法确保安全有效的输血。因此用于献血员血型抗原检测的稀有血型抗体试剂的质量评价尤为重要。目前用于稀有血型抗体试剂质量评价的方法是基于凝集反应原理利用已知抗原的试剂红细胞表征抗体的特异性，但由于红细胞试剂浓度低、抗原性弱，且不同厂家不同批号之前细胞有差异；同时凝集反应灵敏度低，特异性低，无法实现多重检测，因此评价稀有血型抗体试剂的质量存在一定弊端。红细胞意外抗体检定一直是输血安全关注的焦点，为此研发了很多种检测红细胞意外抗体的方法，如：经典抗人球蛋白法、柱凝集法、Capture捕获法等。专利CN00105438.4中通过微柱凝胶法对血小板血型抗原抗体进行检测，为血小板配型。专利CN200710049305.1提供一种利用微流技术检测血型的试剂盒、制备方法及检测方法。然而上述专利中临床血液中红细胞意外抗体的检测普遍存在灵敏度差、动力学线性范围窄、通量化筛选能力低、假阴性问题严重、检测试剂不便于储存等技术问题。专利CN200880019301.1通过将红细胞或红细胞膜片段固定到珠子上实现体外鉴定个体的抗红细胞抗体，然而该专利中所描述的条件参数不可重复，并且该方法应用于红细胞意外抗体的检测时，抗原的包被方式、二抗的加入浓度以及样品的稀释浓度的变化都会影响检测的准确性，因此需要对该方法进行重新设计和评估。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术专利技术人通过对红细胞意外抗体的检测方法和检测条件的优化，提供一种灵敏度、准确性好的血型抗原芯片及其在检测红细胞意外抗体或输血配型中的用途。本专利技术的第一方面提供了一种血型抗原芯片，所述的芯片包括血型红细胞膜抗原和载体，所述的血型红细胞膜抗原包被至所述的载体上，所述的血型红细胞膜抗原能够结合红细胞意外抗体。本专利技术所述的血型红细胞膜抗原选自以下组成的组：纯化血型抗原、重组表达带有特定糖基修饰的红细胞膜抗原、化学合成带有特定糖基修饰的红细胞膜抗原、从红细胞分离得到的红细胞膜。更优选的，所述的血型红细胞膜抗原为从红细胞分离得到的红细胞膜，所述的分离方法选自冷冻复融法、溶剂提取法等，例如是专利CN106754692A、专利CN101109755A、非专利“两种提取红细胞膜蛋白方法的比较”(细胞与分子免疫学杂志，1997(2)：44-45)中记载的方法。特别优选的，所述的血型红细胞膜抗原采用冷冻复融法制备得到，例如，包括如下步骤：(1)取压积红细胞，加入生理盐水于-20℃--200℃冰冻，再于20℃-40℃融化；(2)离心，去上清，洗涤，得到的白色的沉淀物。本专利技术所述的血型红细胞膜抗原包含有D、C、E、c、e、JKa、JKb、M、N、S、s、Kpa、Kpb、Lua、Lub、Fya、Fyb、K、k、Lea，Leb和P1中的一种或两种以上的组合。本专利技术所述的载体为微球，所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种或两种以上的组合，优选的，本专利技术所述的载体为聚苯乙烯微球，特别优选的，本专利技术所述的载体为结合有荧光染料的聚苯烯微球。优选的，本专利技术所述的血型红细胞膜抗原包被至载体的量为1-90μg/1.25×105个微球。更优选的，所述的血型红细胞膜抗原为从红细胞分离得到的红细胞膜时，所述的从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量为45-90μg/1.25×105个微球，特别优选的，所述的从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量为45μg/1.25×105个微球。本领域技术人员可以理解，当所述的血型红细胞膜抗原为纯化血型抗原时，所述的血型红细胞膜抗原包被至载体的量可以低于从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量，例如可以是1-10μg/1.25×105个微球，特别是1-2μg/1.25×105。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的血型抗原芯片为液体芯片，所述的血型抗原芯片中包被有血型红细胞膜抗原的微球悬浮于保存液中。本专利技术的第二方面提供了一种血型抗原芯片在如下用途中的应用：(1)红细胞意外抗体的筛查及鉴定；(2)红细胞意外抗体的定量检测；(3)输血配型。优选的，本专利技术所述的血型抗体为红细胞意外抗体，所述的红细胞意外抗体选自Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统、Luth血型系统等。本专利技术的第三方面提供了血型抗原芯片的制备方法，所述的方法包括：(1)微球的预处理：将微球超声重悬；(2)微球的活化：将微球依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、碳二亚胺(EDC)活化；(3)向微球溶液中加入血型红细胞膜抗原进行偶联，所述的血型红细胞膜抗原能够结合红细胞意外抗体。优选的，所述的血型红细胞膜抗原包被至载体的量为1-90μg/1.25×105个微球，更优选的，所述的血型红细胞膜抗原为从红细胞分离得到的红细胞膜，所述的从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量为45-90μg/1.25×105个微球，特别优选的，所述的从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量为45μg/1.25×105个微球。优选的，所述步骤(2)中Sul本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，包括：(1)将血型红细胞膜抗原包被至载体，所述的血型红细胞膜抗原能够结合红细胞意外抗体，所述的载体为微球，所述的血型红细胞膜抗原包被至载体的量为1‑90μg/1.25×10
【技术特征摘要】
1.一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，包括：(1)将血型红细胞膜抗原包被至载体，所述的血型红细胞膜抗原能够结合红细胞意外抗体，所述的载体为微球，所述的血型红细胞膜抗原包被至载体的量为1-90μg/1.25×105个微球；(2)使检测样品与包被至载体的抗原接触；(3)加入标记有标记物的二抗；(4)针对标记物进行信号检测。2.权利要求1所述的一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，所述的血型红细胞膜抗原为从红细胞分离得到的红细胞膜，所述的从红细胞分离得到的红细胞膜包被至载体的量为45-90μg/1.25×105个微球。3.权利要求1或2任意一项所述的一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种或两种以上的组合。4.权利要求1所述的一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，所述的血型红细胞膜抗原包含有D、C、E、c、e、JKa、JKb、M、N、S、s、Kpa、Kpb、Lua、Lub、Fya、Fyb、K、k、Lea，Leb和P1中的一种或两种以上的组合。5.权利要求1所述的一种红细胞意外抗体的鉴定或检测方法，其特征在于，所述检测样品稀释后再与包被至载体的抗原接触，所述检测样品的稀释倍数为1:10-1:90。6.权利要求1所述的一种红细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪德清，杨璐，于晓波，
申请(专利权)人：汪德清，
类型：发明
国别省市：北京,11
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