用于使用质谱法检测尿素循环障碍的新方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及使用液相色谱‑质谱(LC‑MS)法的用于高通量筛查和分析代谢障碍的新生儿筛查试剂盒、方法、稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液。所述代谢障碍可以是氨基酸、有机酸或脂肪酸氧化障碍，特别是尿素循环障碍或缺乏、高血氨症、高鸟氨酸血症‑高氨血症‑高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症。所述新生儿筛查试剂盒、方法、稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液特别适用于代谢障碍的新生儿筛查(NBS)。

Novel methods and kits for the detection of urea cycle disorders using mass spectrometry

The present invention relates to the use of liquid chromatography mass spectrometry (LC MS) for newborn screening kit, stable method, high-throughput screening and analysis of metabolic disorder isotope labeled internal standard solution or internal standard method. The metabolism of amino acids, can be organic acid or fatty acid oxidation disorders, especially urea cycle disorders, or lack of hyperammonemia, hyperornithinemia hyperammonemia high citrullinuria (HHH) and / or argininosuccinic aciduria. The neonatal screening kits, methods, stable isotope labeled internal standards, or internal standard solutions are particularly useful for neonatal screening of metabolic disorders (NBS).

【技术实现步骤摘要】
用于使用质谱法检测尿素循环障碍的新方法和试剂盒
本申请提供了使用液相色谱-质谱(LC-MS)法的用于高通量筛查和分析代谢障碍的方法、试剂、内部标准溶液和试剂盒。所述代谢障碍可以是氨基酸、有机酸或脂肪酸氧化障碍，特别是尿素循环障碍或缺陷、高血氨症、精氨琥珀酸尿症和/或高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)。所述方法、试剂、内部标准溶液和试剂盒特别适用于在新生儿中进行多个外筛查测试并且以高速检测一组代谢障碍，以确认和/或追踪相同的疾病。
技术介绍
目前，根据所筛查的特定的障碍，使用多种方法来进行生物学障碍的筛查，特别是这些障碍的新生儿筛查(NBS)。目前，许多团体(party)使用与串联质谱法偶联的电喷射离子化作用(ESI-MS/MS)来进行NBS的氨基酸和酰基肉碱分析。与质谱法(MS)偶联的液相色谱法(LC)也已用于NBS。待在新生儿中检测的特定的新生儿代谢缺陷是尿素循环缺陷。尿素循环是在哺乳动物中将有毒的代谢物氨和多余的氮处理为尿素的代谢途径。尿素循环在防止有毒的含氮化合物的积累中发挥重要作用，并且还包含精氨酸的从头生物合成和降解所需的几种生物化学反应。如图1所示，尿素循环由五种酶催化：氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(ALS)和精氨酸酶(ARG1)。尿素循环的前两种酶位于线粒体基质中，其余三种酶在细胞质中。CPS1在第一步中促使从铵离子和二氧化碳形成氨甲酰磷酸。接下来的反应由OTC催化，其将氨甲酰基从氨甲酰磷酸转移到鸟氨酸以形成瓜氨酸。ASS在第三步中参与从瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，并且ASL在第四步中促使从精氨琥珀酸形成精氨酸和延胡索酸。ARG1在第五步中催化从精氨酸形成鸟氨酸和尿素。此外，N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)催化N-乙酰谷氨酸的形成，N-乙酰谷氨酸激活CPS1。因此，尿素合成代谢途径的中断可由所述级联中具体步骤中涉及的几种酶的任一种的缺乏或失活而引起。生成尿素的途径中的缺陷具有两个结果：精氨酸成为必需氨基酸(除了在精氨酸酶缺乏症中，在这种情况下所述酶的缺乏引起精氨酸降解障碍)，以及氮原子在多种分子中累积，累积方式随具体的酶的缺乏而，但是在所有未处于代谢控制下的尿素循环障碍中氨和谷氨酰胺的血浆水平增加。尿素循环障碍(UCD)包括：(a)氨甲酰磷酸转移酶缺乏症(CPSD或CPS1)，(b)N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症(NAGS)，(c)鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTCD)，(d)精氨琥珀酸合成酶缺乏症(ASD)，(e)精氨琥珀酸裂解酶缺乏症或1型瓜氨酸血症(ALD或ASS1)，以及(f)精氨酸酶缺乏症(ARG1)。除了作为伴X染色体的一般障碍的OTCD，尿素循环障碍以常染色体阴性方式遗传。这些疾病中的每一种均代表尿素循环中通常表达的酶之一的生物合成的缺陷，其特征在于由尿素前体(主要是氨，其次为谷氨酰胺)的累积诱导的体征和症状。这些临床障碍的常见病理后遗症是血浆氨水平的极度升高(高氨血症)。严重尿素循环障碍的特征为，血浆氨水平约为2000至2500mg/dL。高氨血症的检测对于早期诊断和有效治疗最为重要。高氨血症通常与氨累积增加有关，呕吐的急性发作、异常肝酶水平、嗜睡、抽搐和昏迷。即使经过治疗，长期的严重高氨血症也会导致智力和身体迟缓。但是，存在质疑引入通用的UCD新生儿筛查的已有临床状况。在所述疾病范围的轻度阶段(atthemildendofthespectrum)，有患者被描述为疾病迟发，仅有单一或很少的症状，甚至没有症状，以及仅有生物化学表型。这些患者(例如在ASS缺乏症的情况下)被描述为患有1型轻度瓜氨酸血症，这是一种与典型的1型瓜氨酸血症等位的病症，然而程度轻得多并且需要更少(如果需要的话)的医学干预。这样的患者通常在新生儿筛查程序中被识别出，并已经讨论了所述轻度病况是否是由早期检测和启动治疗引起，或由相关的残余的酶或转运蛋白功能引起。已经认为代谢物和/或突变分析可有助于识别症状较轻的患者，以试图避免无疾病的错误描述(stigmatisation)、对患者的可能的不必要的治疗和患者的不必要的焦虑，但是迄今为止尚未提供确定的解决方案。在ASS缺乏症(瓜氨酸血症)和ARG1缺乏症(高精氨酸血症)的情况下，在血液和尿中都有各自底物(瓜氨酸和精氨酸)的显著累积。在ASL缺乏症中，由于低肾脏阈值，底物精氨琥珀酸不以任何显著的量在血液中累积。但是，一些瓜氨酸确实在血液中累积，并且大量精氨琥珀酸被排到尿中。在这方面，最近的UCD指南总结，目前不推荐近端(proximal)障碍的NBS，但是可考虑将其用于远端(distal)UCD。实际上，开发基于对血液或尿中酶或累积的底物的直接测量的UCD筛查测试的尝试限于循环中的最终步骤，因为对于前面的步骤，酶(例如，NAGS、CPS1和OTC)被限制在线粒体中，因此没有底物累积(图1)。但是，从技术上讲，直接测量干血斑点中的氨几乎是不可能的。从2001年起，通过使用精氨酸和瓜氨酸作为标记物，在美国的一些州(加利福尼亚州、马萨诸塞州、密歇根州、纽约州、纽瓦克州、威斯康星州)中在扩展的新生儿筛查程序中已包含ASSD和ASLD。从2006年起，通过使用瓜氨酸作为标记物，在整个美国已筛查ASSD和ASLD，其作为“推荐统一筛查组”的一部分。来自6077736名新生儿的公开数据(覆盖从2001年至2012年不同的州)得到所述两种障碍的1/117000新生儿的累积发病率。尿素循环的一种最常见和严重的缺陷——OTC缺乏症——被考虑包含于所述组中，但是由于缺少已在一般的新生儿群体中被验证的筛查测试，它不符合指定的评估标准。作为伴X染色体的障碍，OTC缺乏症具有较大的临床变异性并且可表现为在出生后前几天中危及生命的严重的新生儿发病形式，或通常更轻度的疾病的迟发形式。女性携带者也可经历与血氨水平增加相关的症状。OTC缺乏症的实验室指征为谷氨酰胺和氨浓度升高、低瓜氨酸，以及尿中乳清酸的排泄升高。因此，NBS实验室已经试图使用低瓜氨酸和若干比值来鉴定处于OTC缺乏症风险的婴儿，但是迄今为止取得的成功有限。为了强调使用低瓜氨酸作为标记物以检测近端UCD的困难，在2001年至2008年期间，在Tuscany应用LC-MS/MS进行了一项研究。作者得出结论，低瓜氨酸血症并不是OTCD新生儿筛查的可靠标记物，特别是对于可表现出正常瓜氨酸水平的迟发形式而言。在其他代谢障碍中也可发现低瓜氨酸浓度，这进一步质疑了它作为筛查标记物的用途。因此，最近的UCD指南得出结论：目前不能推荐用于近端障碍的NBS，但是可考虑将其用于远端UCD。尽管在患有OTC缺乏症的患者的尿中乳清酸通常升高，仍无法可靠地将它用作血液中的标记物。尽管所有UCD均影响尿素循环功能并因此导致高氨血症，但它们的生物化学特征(profile)是非常不同的。关于新生儿尿素循环缺陷筛查的若干其他限制是，目前无法可靠地检测CPS1缺乏症、OTC缺乏症和NAGS缺乏症。此外，尽管已通过这些方法检测高精氨酸血症或ARG1缺乏症，仍无法预期新生儿筛查能够可靠地检测所有的情况。即使在可通过新生儿筛查检测的UCD中，新生儿通常在获得筛查结果之前就表现本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过串联质谱法在从受试者获得的样品中检测一种或多种代谢物的存在和/或测量其水平的方法，所述代谢物至少包括谷氨酰胺，并且所述方法包括以下步骤：(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；以及(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量。

【技术特征摘要】
2015.09.02 EP 15183561.8;2015.10.06 EP 15188615.71.一种通过串联质谱法在从受试者获得的样品中检测一种或多种代谢物的存在和/或测量其水平的方法，所述代谢物至少包括谷氨酰胺，并且所述方法包括以下步骤：(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；以及(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量。2.根据权利要求1的方法，所述方法用于体外诊断选自尿素循环障碍和/或高氨血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症的一种或多种代谢缺陷，所述方法还包括步骤(vii)，其中与谷氨酰胺的生理水平相比检测到步骤(vi)中获得的谷氨酰胺水平升高。3.根据权利要求1或2的方法，其中在所述样品中进一步检测和定量选自氨基酸、有机酸、酰基肉碱、多种肉碱和/或琥珀酰丙酮的一种或多种代谢物，其中所述方法还包括步骤(v)以通过分析步骤(iv)中获得的MRM质谱图确定所述一种或多种代谢物的存在和/或量。4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述氨基酸包括天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸、丙氨酸、N-乙酰谷氨酸、甘氨酸、精氨琥珀酸和/或氧代脯氨酸，并且/或者其中所述有机酸包括乳清酸，或所述酰基肉碱或多种肉碱包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品是干燥的和/或至少包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，并且还包括对应于以下的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、氧代脯氨酸、脯氨酸、精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述样品是体液样品，优选血液样品，更优选干燥的血液样品，和/或其中所述受试者是疑似患有代谢障碍的受试者，例如新生儿、婴儿或儿童，优选新生儿。7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述离子化步骤(iii)是通过将所述提取的代谢物和标准品通过液相色谱系统输送至质谱仪的离子源而进行，和/或其中所述数据获得步骤(iv)是使用三级四极质谱仪或高分辨率质谱仪进行，和/或其中所述步骤(v)是通过选择至少一种精确的质荷比(m/z)离子而进行，所述精确的质荷比离子对应于所述样品中存在的所述一种或多种代谢物的至少一种计算的质荷比(m/z)。8.根据前述权利要求任一项的方法，还包括同时或依次进行多肽分析，所述多肽包括选自以下的多肽：血红蛋白、血红蛋白变体、白蛋白、肌红蛋白、细胞色素、细菌酶、抗原性的肽决定簇、糖蛋白和与多种先天性障碍相关的变体蛋白，其中所述方法还包括步骤(v)测定所述样品中所述多肽的酶活性，和/或(vi)测定所述多肽的氨基酸组成。9.一种新生儿筛查试剂盒，其用于根据权利要求1-11任一项的方法通过串联质谱法在新生儿的血液...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·卡拉德，R·芬格哈特，
申请(专利权)人：实验室系统诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI