乙型肝炎疫苗及其制备方法技术

乙型肝炎病毒免疫原性复合多肽，特征在于所说的免疫原性多肽包括至少部分ＨＢＶ前Ｓ２区的氨基酸序列，和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、ＨＢＶ　　ＤＮＡ聚合酶的其他四个连续的ＨＬＡ限制性抗原表位的氨基酸序列及由之形成的空间结构。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术的所属领域本专利技术涉及衍生于乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的免疫原性多肽，特别是涉及包括乙型肝炎抗原多个HLA限制性表位的复合多肽，其制备方法及其作为预防/治疗性乙型肝炎疫苗的应用。专利技术的背景乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的的病毒性传染病。在中国、东南亚和热带非洲地区，人群感染率高达50％-70％，HBV携带者高达8％-15％。其中，中国的HBV携带者多达1亿多人，约占我国人口的10％，占全世2亿多HBV携带者的50％以上。中国的乙型肝炎患者约占所有慢性肝炎患者的80％，而且其中大约有10％的急性乙型肝炎可能转为慢性肝炎、肝硬化或肝癌，因此是严重危害人群健康的传染病之一。大规模乙型肝炎疫苗接种是预防HBV感染的有效措施，但仍有约10％-20％的乙肝患者对疫苗无反应性。目前，除干扰素可使少部分乙肝患者获得痊愈外，尚没有其它特效的治疗药物。乙肝治疗一直是世界上难以解决的医学及社会难题。因此，开发同时有治疗与预防作用的HBV疫苗具有重要的理论意义及潜在巨大的经济及社会价值。Dane等人发现乙型肝炎病毒在血液中存在三种不同形态的抗原完整HBV的42μm颗粒，只含病毒外膜结构的22nm颗粒，以及由内病毒外膜结构组成的丝状体。此后，Krugman和Hi lleman等人证明22nm表面抗原颗粒能在猩猩和人体内有效地引发保护性免疫反应，进而使用从HBV携带者血清中分离的22nm的HBV表面抗原颗粒制备了血源性乙型肝炎疫苗。二十世纪八十年代，Rutter等人和Tiollai等人先后在酵母和哺乳动物细胞中成功表达了HBV表面抗原，并相继投入工业化生产。这些基因重组乙型肝炎疫苗取得了比血源乙型肝炎疫苗更好的免疫效果，为预防乙型肝炎提供了重要措施。预防性疫苗的接种对象是健康人群。作为一种安全可靠的被动免疫因子，预防性疫苗已在世界范围内广泛用于传染病的预防接种，并在预防和消除许多传染病中发挥了重要作用。相反，治疗性疫苗的接种对象则是持续感染患者或病原体携带者。治疗性疫苗的使用旨在打破机体的免疫耐受，提高机体特异性免疫应答水平。作为一种主动免疫治疗因子，治疗性疫苗的成分相对比较复杂，而且可能对机体的免疫系统造成一定的损伤，但其作为传染病综合治疗中的一种提高免疫力的辅助手段，仍具有广阔的发展前景，特别是对于那些迄今尚无有效治疗方法的传染病(例如肝炎和爱滋病等)。因此，针对乙型肝炎防治的现状，发展有效的治疗/预防性乙型肝炎疫苗，将具有十分重要的意义。专利技术的目的本专利技术的一个目的是提供乙型肝炎病毒免疫原性复合多肽，特征在于所说的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2区的氨基酸序列，和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四个连续的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的复合多肽还包括一个辅助性T淋巴细胞表位PADRE的氨基酸序列和一个CpG岛核心序列。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的乙型肝炎病毒抗原表位分别是相当于乙型肝炎表面抗原前S2区第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn；相当于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal；相当于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThrThrValValArgArg；相当于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸并且N末端带有甘氨酸接头的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle；相当于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle，以及相当于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的免疫原性肽还可包括具有氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla(SEQ ID NO7)的辅助性T细胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal(SEQ ID NO8)的CpG岛核心序列。根据本专利技术的一个优选实施方案，构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由上述肽片段以任何排列方式串联连接的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽的每两个独立的序列之间均有由一个或多个甘氨酸构成的接头。本专利技术的另一个目的是提供制备如上限定的乙型肝炎病毒免疫原性多肽的方法，该方法包括以下步骤(1)分别分段合成编码如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；(2)分步退火连接步骤(1)的核苷酸小片段，得到长度约399bp的全复合基因序列；(3)将步骤(2)的多核苷酸连接到适当的载体中；(4)用步骤(3)的重组载体转化适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的重组体细胞，并从培养物上清和细胞内分离所需的乙型肝炎病毒免疫原性多肽。根据本专利技术方法的一个优选实施方案，其中所说的全复合基因序列也可以是以一次连续方法合成的。根据本专利技术方法的一个优选实施方案，其中所说的小片段长度约10-30个碱基。根据本专利技术方法的一个优选实施方案，其中所说的载体是质粒pWR450-1。根据本专利技术方法的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌细胞。本专利技术的再一个目的是提供上述乙型肝炎病毒免疫原性多肽作为治疗/预防性乙型肝炎疫苗的应用。附图简要说明附图说明图1显示本专利技术的治疗/预防性抗原基因HBV-P/T的分步退火拼接方案。图2显示HBV-P/T抗原基因的全序列。图3是重组质粒pWR450-1/HBV-P/T的构建图。图4是重组质粒pWR450-1/HBV-P/T的酶切鉴定图。其中泳道1是100bp的DNA标志物；泳道2是BamHI/EcoRI双酶切的载体质粒pWR450-1；泳道3是BamHI/EcoRI双酶切的重组质粒pWR450-1/HBV-P/T；泳道4是载体质粒pWR450-1；泳道5是重组质粒pWR450-1/P/T。图5显示重组质粒pWR450-1/HBV-P/T在大肠杆菌中表达产物的纯化和western-blotting免疫印迹分析。其中泳道1是低分子量蛋白质标志物；泳道2和3是纯化的复合多肽；泳道4是空载体表达的β-半乳糖酐酶蛋白。图6显示本专利技术的融合多肽和载体蛋白免疫Balb/c小鼠后特异性IgG抗体水平的比较。图7显示以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测接种本专利技术融合多肽或载体蛋白的Balb/c小鼠的CTL活性比较。图8显示被免疫小鼠体内CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的流式细胞分析。图9显示以RT-PCR方法检测的被免疫小鼠脾细胞内细胞因子特异性mRNA水平。专利技术的详细内容本专利技术涉及衍生于乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的免疫原性多肽，特别是涉及包括乙型肝炎抗原的多个HLA限制性表位的重组多肽，其制备方法及其作为预防/治本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，骆利敏，王萍，
申请(专利权)人：热带病研究所，
类型：发明
国别省市：