一种突变的免疫球蛋白-结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种免疫球蛋白－结合蛋白，其中至少一个天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸，与亲本分子相比该突变在ｐＨ值最高达１３－１４时赋予了增加的化学稳定性。蛋白可例如获自能够与免疫球蛋白分子的除互补决定区（ＣＤＲ）之外的其它区域结合的蛋白，诸如蛋白Ａ，且优选地为葡萄球菌蛋白Ａ的Ｂ－结构域。本发明专利技术也涉及一种用于亲和性分离的基质，其含有作为偶联于固相载体的配体免疫球蛋白－结合蛋白，在其中的蛋白配体中至少有一个天冬酰胺残基已突变为除了谷氨酰胺之外的氨基酸。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及突变体蛋白领域，更具体地涉及一种与亲本分子相比显示出提高的稳定性的突变体蛋白以及涉及一种生产本专利技术的突变体蛋白的方法。本专利技术也涉及一种亲和性分离基质，其中本专利技术的突变蛋白质被用作亲和配体。
技术介绍
在生物技术和制药工业中的大量的应用需要广泛关注污染物的严格去除。这些污染物可以是例如色谱分析方法中固定相或基质吸附的非洗脱分子，诸如非目的的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂类、细菌和病毒。通常进行目的产物的第一次洗脱之后从基质去除这些污染物，以便在随后的应用之前再生基质。此类去除通常包括被称为就地清洗(CIP)的方法，其中使用了能够从固定相洗脱污染物的试剂。通常使用的这类试剂为流经所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的净化和清洁试剂是NaOH，且其浓度可依据污染的程度和本性在0.1直至例如1M的范围内。已知NaOH是一种能实现多途径地减少污染物诸如微生物、蛋白质、脂类和核酸的有效CIP试剂。NaOH的另一个优点是其可以很容易地被去除而不用任何进一步的处理。然而，此方案涉及将基质暴露于超过13的pH值。对于许多含有蛋白亲和配体的亲和层析基质来说，这样的碱性环境是非常粗糙的条件，并且因此由于配体对所涉及的高pH值的不稳定性而导致了基质能力的降低。因此广泛的研究集中于开发对碱性pH值具有增大的耐受能力的基因工程蛋白质配体。例如，Gulich等(Susanne Gülich，MartinLinhult，Per-ke Nygren，Mathias Uhlén，Sophia Hober，Journalof Biotechnology 80(2000)，169-178对碱性条件的稳定性可被工程改造到蛋白配体中)提出通过蛋白质工程来增加结合链球菌白蛋白的结构域(ABD)在碱性环境中的稳定特性。以前，人们表明了天冬酰胺和谷氨酰胺残基在碱性条件下的结构修饰，诸如肽主链的脱酰胺化和裂解是在碱性溶液处理后活性损失的主要原因，且天冬酰胺是两个中最敏感的(Geiger，T.，和S.Clarke.1987.肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰残基的脱酰胺化、异构化和外消旋作用。J.Biol.Chem.262785-794)。已知脱酰胺化速率是高度特异性和构象依赖的(Kosky，A.A.，U.O.Razzaq，M.J.Treuheit，和D.N.Brems.1999.α-螺旋对天冬酰胺残基稳定性的影响不同螺旋性的肽中的脱酰胺化速率。Protein Sci.82519-2523；Kossiakoff，A.A.1988.三级结构是蛋白脱酰胺化的主要决定因素。Science.240191-194；和Lura，R.，和V.Schirch.1988.肽的构象在天冬酰胺酰残基的脱酰胺化速率和机制中的作用。Biochemistry.277671-7677)，且最短的脱酰胺化的半衰期与序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-丝氨酸相关。相应地，Giilich等人创造了一种ABD的突变体，其中天然ABD的所有四个残基已被亮氨酸(一个残基)，天冬氨酸(两个残基)和赖氨酸(一个残基)所替代。此外，Giilich等人报道了他们的突变体显示出类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，而且含有工程改造的配体的亲和层析柱在重复暴露于碱性条件之后，比利用父本的非工程改造的配体制备的柱显示出较高的结合能力。因此，断定其中的所有四个天冬酰胺残基可被替代而对结构和功能没有任何显著的影响。因此，Giilich等人针对结合链球菌白蛋白的结构域进行了研究。然而，亲和层析也用于纯化其它分子诸如例如用于药物应用的免疫球蛋白的操作流程中。一类特别有趣的亲和性试剂是能够特异性结合于抗体分子的不可变部分的蛋白质，此类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。此类试剂可广泛地用于通过亲和性色谱层析从不同的样品诸如但不限于获自原种的血清或血浆制品或细胞培养物中回收免疫球蛋白。此蛋白的一个实例为含有能够结合于来自不同种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域的葡萄球菌蛋白A。基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂取决于其高度的亲和性和选择性在生物
找到了广泛的应用，例如，用在捕获和纯化以及检测抗体的亲和层析中。目前，基于SpA的亲和性培养基可能是最广泛应用的从不同样品包括来自细胞培养物的工业原料来分离单克隆抗体及其片段的亲和性培养基。因此，含有蛋白A-配体的不同基质可市售得到，例如以天然蛋白A的形式(例如，Protein A Sepharose，AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)且也包括以重组蛋白质A(例如，ProteinA Sepharose，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)的形式市售的。更具体地，在所述商品化的重组蛋白质A产物上进行的遗传操作的目的在于促进其对载体的附着。因此，在此领域需要获得能够结合免疫球蛋白的蛋白配体，特别是通过其Fc-片段结合免疫球蛋白的蛋白配体，这些蛋白配体也对一种或多种利用碱性试剂的净化方法有耐性。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供一种突变的免疫球蛋白结合蛋白配体，其在增加的pH值下显示出提高的稳定性，因此与亲本分子相比对在碱性条件下的净化有提高的耐性。本专利技术的另一个目的是提供这样的一种蛋白配体，其特异性地结合于免疫球蛋白诸如IgG、IgA和/或IgM的Fc-片段。本专利技术的再一个目的是提供一种如上所述的蛋白配体，其在碱性条件下比亲本分子显示出能保持较长时间的亲和性。本专利技术进一步的目的是提供一种亲和性分离基质，其含有能够优选地通过它们的Fc-片段结合免疫球蛋白诸如IgG、IgA和/或IgM的突变蛋白配体，这些配体与亲本分子的配体相比在碱性条件下显示出提高的耐性。上述所限定的一或多个目的可通过所附的权利要求书来实现。附图的简要说明附图说明图1显示了SpA的5个同源结构域(E，D，A，B和C)的氨基酸比对。图2(a)和(b)说明了在对本专利技术的突变蛋白进行碱处理(原位清洗)之后获得的与不稳定的蛋白Z相比较的结果。图3显示了如实施例4(a)所述在插入载体中之后编码Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。图4显示了实施例4(a)所述的质粒pAY91的质粒图谱。图5显示了如实施例4(b)所述在插入载体中之后编码Z(N23T/N3A/N6D)的基因。图6显示了实施例5所述质粒pAY100的质粒图谱的实例。图7显示了根据实施例6的用于将KpnI-位点导入到具有SPA启动子和信号序列的载体中的衔接子。图8显示了如实施例6所描述的质粒pAY104，其含有用于导入含有KpnI-位点的衔接子的SPA启动子和信号序列。图9显示了根据实施例6在插入衔接子之后产生的质粒pAY128。图10显示了实施例6的构建的克隆盒，其中在原始的衔接子下加了下划线。图11显示了如实施例6所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚体之后的质粒pAY114。图12显示了实施例7的构建的克隆盒，其中在原始的衔接子下加了下划线。图13显示了根据实施例7在插入衔接子之后产生的质粒pAY129。图14显示了如实施例7所述在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys之后的质粒pAY125。图15为实施例8所述的通过分离人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够结合于免疫球蛋白分子的除互补决定区（ＣＤＲ）之外的其它区域的免疫球蛋白－结合蛋白，其中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１或２所定义的亲本免疫球蛋白－结合蛋白或其功能性变体的至少一个天冬酰胺残基，已经突变为除了谷氨酰胺之外的其它氨基酸，与亲本分子相比，该突变赋予了在碱性ｐＨ值下的提高的化学稳定性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S霍伯，
申请(专利权)人：阿默森生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]