新型清蛋白制造技术

本发明专利技术涉及突变型血清清蛋白，与衍生突变体的天然清蛋白相比它们展示改变的金属结合和／或其它特征，以及这些突变型清蛋白在医学领域或培养中细胞生长的用途。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及突变型血清清蛋白，与衍生突变体的天然清蛋白相比它们展示改变的金属结合和/或其它特征，以及这些突变型清蛋白在医学领域或培养中细胞生长的用途。
技术介绍
人清蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。通常，它以大约750μM的浓度存在。它是585个氨基酸的单个多肽链，主要是螺旋状三结构域结构。由假定的“加帽”位点至添加poly(A)的第一个位点，人血清清蛋白基因包含16,961个核苷酸。清蛋白是血液中的主要运输蛋白，而且能够可逆结合广泛的小分子，诸如脂肪酸、激素、和药物。清蛋白还参与许多金属离子的运输和储存。目前，人清蛋白在临床上用于治疗严重烧伤、休克、或失血的患者。其它哺乳动物清蛋白与人清蛋白高度同源。已知锌和铜分别以3.4×107和1.5×1016M-1的结合常数结合清蛋白(Masuoka等人，1993，J.Biol.Chem.，268，21533-21537)。Cu2+最强烈的结合清蛋白的N末端氨基酸Asp1-Ala2-His3，它提供了4N配基的正方平面位点，尽管知道分子上存在其它结合位点。血浆中大约75％的Zn2+(大约14μM)结合清蛋白。这占到血清中Zn2+可交换级分的高达98％(Giroux等人，1976，J.Bioinorg.Chem.，5，211-218；Foote和Delves，1984，Analyst，109，709-711)。先前已经显示了清蛋白调控内皮细胞的锌摄取，尽管已经在体外用清蛋白—锌复合物证明了由受体介导的囊泡共运输穿过内皮(Bobilya等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，202，159-166；Tibaduiza等人，1996，J.Cell.Physiol.，167，539-547)。先前尚未明确定位清蛋白上的Zn2+结合位点，尽管认为清蛋白是循环中的主要锌运输蛋白。锌是身体的必需元素，而且在超过300种酶中存在。它具有许多重要作用，包括维生素A的运输、伤口的愈合、男性的生精，而且受到炭疽致死因素和细菌肠毒素的征募。因此，血液中锌水平的调控在生理学上非常重要。已经提出由血液补充Zn2+可用于提高某些结合金属有机药物对蛋白质和酶的亲和力，如丝氨酸蛋白酶诸如胰蛋白酶的苯并咪唑抑制剂(Katz和Luong，1999，J.Mol.Biol.，292，669-684；Jane等人，2000，Biochemistry，39，4792-4800；Katz等人，2001，Chem.& Biol.，8，1107-1121；Liang等人，2002，J.Am.Chem.Soc.，)。Reed和Burrington(1989，J.Biol.Chem.，264，17，9867-9872页)关注清蛋白与肝细胞的结合以及这是否牵涉清蛋白的细胞表面受体。作者提出，他们的工作提供了证据表明清蛋白对肝细胞表面的可逆吸附而且伴随的构象变化增强了清蛋白与肝细胞表面之间的相互作用。然而，尚未提出可能发生哪种构象变化或者如何控制它。Bos等人(1989，J.Biol.Chem.，264，2，953-959页)关注经由组氨酸残基的Ca2+离子结合对人血清清蛋白中性—碱性转变的分子机制。论文揭示了中性—碱性转变可能在药物的药代动力学中发挥作用，但是并未提出生成突变型血清清蛋白或者提出这些突变体可能具有的任何作用。专利技术概述本专利技术基于如下最初发现位于结构域I与II之间界面的一簇四个氨基酸(His67、Asn99、His247、和Asp249)参与锌、铜、和/或镉的结合位点(见附图说明图1和2)。所有这四个残基在至今所有哺乳动物清蛋白序列中是高度保守的(见表1)。本文提及的编号指前清蛋白原(preproalbumin)序列在翻译后受到切割之后在人血清清蛋白氨基酸序列特定位置发现的氨基酸(见表1)。这一位点的鉴定为治疗性清蛋白的设计提供了基本原理，它们用于控制血液中的可利用锌和/或其它金属离子水平并将它们投递至靶组织。本专利技术还基于如下观察结果突变型清蛋白影响细胞粘附。由此，在第一个方面中，提供了分离的突变型血清清蛋白，突变使得与衍生突变体的天然清蛋白相比，突变体展示改变的金属结合亲和力和/或其它生理学特征。设想本专利技术涵盖下文定义的导致金属结合和/或其它生理学特征改变的对天然清蛋白序列的任何突变。对于熟练从业人员而言，相对简单的任务是生成特定突变体并根据本文描述的实验测试法来测试这种突变体是否展示改变的金属结合和/或其它生理学特征。可以突变的优选残基经鉴定是表1中所标示的残基X1-X11和/或可以根据对特定血清清蛋白测定的晶体结构确定的可以与任何这些残基形成氢键的残基。在第二个方面中，提供了本质上包含如下氨基酸序列的分离的突变型人血清清蛋白DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQX5LQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLX1TLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERX2X8CFX6QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRX9PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVX10TECCX3X7X4LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSX11CIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL其中X1不同于H；X2不同于N；X3不同于H；X4不同于D；X5不同于Y；X6不同于L；X7不同于G；X8不同于E；X9不同于H；X10不同于H；和/或X11不同于H，使得与天然人血清清蛋白相比，所述突变体展示改变的金属结合亲和力和/或其它生理学特征。可以理解，全文使用常规的单字母氨基酸命名法。可以对其它天然氨基酸进行氨基酸替代，尤其是由DNA直接编码的20种氨基酸，或者例如可以是本领域熟练技术人员知道的合成的或非常见的氨基酸。上文所示序列基于在Genbank数据库中找到的人血清清蛋白序列。人血清清蛋白包含上文所示序列，其中X1是H、X2是N、X3是H、X4是D、X5是Y、X6是L、X7是G、X8是E、X9是H、X10是H、且X11是H。由此，依照本专利技术的突变型血清清蛋白与特定种类“清蛋白”天然氨基酸的X1-X11位置相比通常在所述位置包含至少一处突变。然而，应当意识到物种的个体之间可以存在天然变异，使得序列中可能存在微小变异。可以理解，序列中不同于在X1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的突变型血清清蛋白，其被突变使得与衍生突变体的天然清蛋白相比，突变体展示改变的金属结合亲和力和／或其它生理学特征。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬贝雷泽恩科，彼得约翰萨德勒，艾沦詹姆斯斯图尔特，克劳迪娅布林德奥尔，凯丽埃玛布尼安，
申请(专利权)人：爱丁堡大学董事会，戴塔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]