松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法与应用，本发明专利技术的松杉灵芝蛋白多糖混合物，是分子量为６０００－１．２万道尔顿，用包括以下步骤的方法得到的物质：１）松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；２）药渣用去离子水提取，收集提取液；３）将提取液用醇沉淀；４）沉淀物用水溶解后进行微滤；５）滤液经过５０－８０ＫＤ的超滤膜后所得滤液用３－５ＫＤ膜超滤，膜上的截留物经ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ层析分离后得蛋白多糖混合物精制品。本发明专利技术的松杉灵芝蛋白多糖混合物具有显著的抑制肿瘤和提高机体免疫功能作用，具有广阔的药用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白多糖混合物及其制备方法与应用，特别是涉及从松杉灵芝(Ganoderma tsugae Murrill.)中得到的一种蛋白多糖混合物及其提取方法和该蛋白多糖混合物作为注射或口服药物活性成分的应用。
技术介绍
目前临床上治疗肿瘤疾病，主要采用三种方式手术、放疗和化疗，但放疗、化疗严重杀伤人体正常细胞和组织，使许多患者体质迅速下降，甚至不能持续治疗。长期以来，人们在不断寻找新的毒性小、抑瘤率高的抗癌药物，并取得了一定的成效。由于肿瘤的发生和扩散与人体的免疫功能有密切关系，因此产生了肿瘤免疫治疗法。二十世纪中后期，发现了一些来源于真菌类的多糖药物，如云芝多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖等，它们均具有提高机体免疫力及抗肿瘤的作用。这些药物的作用机制一方面是通过宿主中介，激活机体的各种免疫活性细胞，促进各种淋巴因子的分泌，提高机体的抵抗力，达到吞噬和消除肿瘤细胞的作用，另一方面某些多糖，特别是蛋白-多糖对癌细胞有直接杀伤作用，其特点是有效剂量小，抑瘤率高，毒性很小，甚至无毒，与化疗药物共同使用还可以降低化疗药物的毒副作用。与化疗相比，免疫疗法没有白血球降低，呕吐，免疫力下降等毒副作用。松杉灵芝(Gamoderma tsugae Murrill.)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属的一种真菌，具有悠久的民间用药历史，药理活性广泛，且毒性极小。子实体为其地上部分，包括菌盖和菌柄，一起入药，松杉灵芝子实体的化学成分复杂，有三萜类，核苷类，生物碱类，呋喃类，氨基酸类及微量元素等等。水溶性成分主要有多糖类，糖-蛋白类，蛋白-多糖类等等。研究表明，多糖及糖-蛋白或蛋白-多糖类复合物具有提高机体免疫功能和抗癌作用。由于多糖的来源不同，分子量大小及空间三维螺旋结构不同，特别是与蛋白质结合方式不同，在药理活性方面，表现出较大差异。MIZUNO等人从赤芝子实体中获得分子量为100万和45万两种水溶性多糖，经小鼠腹腔注射给药，以S180瘤株做实验，具有显著的抑瘤作用。李荣芷，何云庆等从赤芝中获得分子量分别为16200，24500，35000，和40000四种多糖，该四种多糖均能显著增加正常小鼠脾细胞IL-2的产生。北京医科大学药学院分离出的分子量为7100-9300的灵芝多糖能促进TNFα、TNFγ mRNA的表达，增加TNFα、TNFγ mRNA的分泌等等。目前对赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinersis)的研究比较多。对松杉灵芝(Ganoderma tsugae Murrill.)的研究却罕见报道，其中仅有2003年台湾国际扬名大学在美国申报了名称为《Polysaccharide-based extract fromganoderma，pharmaceutical use thereof，and process for preparing the same》的专利，公开了一种获得松杉灵芝水溶性粗提物的工艺，但该工艺只是涉及到水提醇沉和脱蛋白等步骤，得到的产品是松杉灵芝的初级粗制品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法和以该松杉灵芝蛋白多糖混合物为注射、口服或外用治疗肿瘤药物的活性成分。本专利技术所提供的松杉灵芝蛋白多糖混合物的分子量为6000-12000道尔顿，是用包括以下步骤的方法得到的1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后进行微滤；5)滤液经过50-80KD(5万-8万道尔顿)的超滤膜后所得滤液用3-5KD膜超滤，膜上的截留物为上柱精制前粗品。6)为了得到精产品，超滤后，最后截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱液，经3-5KD膜，浓缩冷冻干燥得到蛋白多糖混合物精制品。在该精制过程中，如果采用DEAE-Sepharose(F.F.)层析柱进行层析，一般选用3×80cm规格的层析柱，上样速度应为0.2-0.5ml/min，用去离子水洗脱的速度应为2-4ml/min，如果采用SepharoseCL-6B层析柱进行层析，一般选用3×70cm规格的层析柱，上样速度应为0.2-0.8ml/min，用去离子水洗脱的速度应为1-2ml/min，如果采用DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱进行层析，一般选用3×75cm规格的层析柱，上样速度应为0.25ml/min，用去离子水作流动相洗脱柱子的速度应为2-4ml/min。在提取松杉灵芝蛋白多糖混合物的过程中，所述用于松杉灵芝子实体脱脂的醇为75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量为所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的6-12倍(8-10倍最好)，脱脂在70-80℃条件下进行，回流提取2-3小时，重复3-6次；所述药渣用去离子水提取，收集提取液中，去离子水的重量是所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的10-30倍(15-25倍最好)，于90-100℃(98-100℃最好)，间歇搅拌，提取2-3小时，重复3-7次，提取液浓缩至所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的7-12倍；所述将提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇使其终浓度达到75-85％，边加边搅拌，在4-10℃低温下放置，离心(8000rpm，15min)得到沉淀；所述微滤进行至少二次，滤膜的孔径第一次为10μm，如果进行二次，滤膜的孔径分别是10μm、3μm为宜，如果进行三次，滤膜的孔径分别是10μm、5μm和1μm为宜。实验证明，以本专利技术的方法制备的松杉灵芝蛋白多糖混合物为活性成分的药物具有明显的抑制肿瘤的作用以及提高免疫功能作用。本专利技术的药物一般制成粉针剂，也可以制成注射液、片剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。以本专利技术的方法制备的松杉灵芝蛋白多糖混合物是一种奶白色或黄白色的片状物，质轻，易溶于水，纯度高，粘度较小，易于选用各种剂型，给药方便。实验表明，本专利技术的药物抑瘤率高，毒性极小，经动物整体实验研究表明，急性毒理LD50未测出，测得最大(注射给药)耐受量125mg/kg(小鼠)，基本无毒，具有广阔的应用前景。具体实施例方式实施例1、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物称取松杉灵芝子实体粉100克，加80％乙醇1升，75-78℃加热回流2小时，重复3次，过滤，向药渣中加去离子水2升，加热煮沸，间隔搅拌，每次提取3小时，重复5次，过滤，合并提取液，浓缩至体积为0.5-1升，冷至室温，加无水乙醇2.5升，边加边搅拌，4℃放置澄清，离心(7000-8000rpm，15min)，取沉淀加水溶解后，10μm和1μm微滤，取滤液，然后超滤过80KD，取滤液，再用3KD膜进行超滤，所得截留物浓缩，冷冻干燥，获得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。实施例2、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物称取松杉灵芝子实体粉100克，加80％甲醇1.5升，80℃加热回流3小时，重复5次，过滤，向药渣中加去离子水4升，加热煮沸，间隔搅拌，每次提取3小时，重复6次，过滤，合并滤液，浓缩至体积1升，冷却，加无水甲醇4升，边加边搅拌，4℃放置澄清，离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种松杉灵芝蛋白多糖混合物，是分子量为６０００－１．２万道尔顿，用包括以下步骤的方法得到的物质：１）松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；２）药渣用去离子水提取，收集提取液；３）将提取液用醇沉淀；４）沉淀物用水溶解 后进行微滤；５）滤液经过５０－８０ＫＤ的超滤膜后所得滤液用３－５ＫＤ膜超滤，膜上的截留物为产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张洁，姜大成，费晓方，
申请(专利权)人：长春中医学院，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]