基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，包括如下步骤：(1)检索病原微生物特征核酸序列片段；(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；(3)提取待检测样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；(4)分析PCR扩增中焦磷酸；(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该病原微生物及其DNA浓度。本发明专利技术的方法可以准确的检测出样本中是否含有该病原微生物及其含量；该检测分析方法灵敏度高，检测快，操作流程简单，容易实施，能对大样本实施快速分析。

【技术实现步骤摘要】
基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，适用于食品安全、饮用水安全监测、临床样本诊断等特定致病微生物的快速鉴定。
技术介绍
引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物(如:沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、志贺氏菌、禽流感病毒、黄曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等)的检测在食品、卫生和医疗领域具有重要的意义。传统的培养法检测操作步骤繁琐、耗时长，不能满足快速检测于诊断的需求。分子生物学为致病性微生物的快速检测提供了可能。原理上，针对某个微生物的定性分析而言，现有非常多得到了广泛的应用的成熟分子生物学方法和技术，大致分为两类。一类是实时跟踪PCR(聚合酶链式反应)：如实时定量PCR技术，实时熔解曲线分析等；另一类是PCR完成后、对PCR产物进行分析：如核酸序列分析的金标准SangerDNA测序技术，DNA芯片技术。上述两类均涉及PCR、且各有优劣，前者快速、但需要昂贵的仪器和试剂；后者繁琐、耗时。发展特定核酸序列片段的快速、低成本检测在诸如卫生、食品等行业越来越受到重视和必需。PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加。然而，在现有的分子生物学检测微生物技术中，所有分析的对象均为PCR反应中产生的DNA序列，其理论量为样本中核酸拷贝数的2N-1(N为PCR循环数)，如果采用电泳等简单、快速的方法分析，则样本中核酸拷贝数目需要达到数百个才能通过电泳条带清晰判断PCR反应是否发生，对低丰度样本无法实施有效检测。实际上，在PCR过程中，每合成一个核苷酸、PCR引物便会延伸一个碱基长度，同时也会伴随产生一个副产物焦磷酸分子。如果每条一条引物在PCR过程中延伸100个碱基，在一对DNA模板在一个PCR过程要产生200个焦磷酸分子；也就是说PCR过程中，产生的焦磷酸分子数目一般为DNA的几百倍。因此，如果检测DNA与焦磷酸的灵敏度相当，则检测焦磷酸分子的灵敏度应当比检测DNA分子提高几百倍。因此，选择分析PCR副产物焦磷酸，而非PCR产物DNA片段其灵敏度更大，更适合低丰度核酸序列的分析。现有非常多的分析方法用于焦磷酸的定量分析技术，应用焦磷酸分析的一个典型例子为焦测序。该技术是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的焦磷酸分子实现的：通过分析单个测序反应中是否有焦磷酸产生、及其产生的量可以判断测序反应是否有核苷酸合成、以及合成的数目。其原理是反应底物为5'-磷酰硫酸、荧光素，在腺嘌呤核苷三磷酸硫酸化酶的作用下，焦磷酸可以和5'-磷酰硫酸结合形成腺嘌呤核苷三磷酸，在荧光素酶的催化下，生成的腺嘌呤核苷三磷酸又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过检测装置可获得一个检测峰，峰值的高低和焦磷酸的量成正比。但是现有技术中通常是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的焦磷酸分子实现的，这种检测依然存在操作流程复杂、耗时长、以及检测限等问题。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术在微生物检测中存在操作流程复杂、耗时长、以及检测限等问题，本专利技术提供一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，该方法根据检测的病原微生物，从公用数据库中检索一段代表该微生物特征的核酸序列片段、并设计一对特异的PCR引物，通过对样本基因组特异PCR扩增、并分析PCR扩增中产生的总焦磷酸判定PCR反应是否发生与发生的多少，从而推导出是否含有该特定的微生物及其DNA浓度。该检测分析方法灵敏度高，检测快，操作流程简单，容易实施，能对大样本实施快速分析。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述的一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据检测的病原微生物，从数据库中检索出一段代表该微生物的特征核酸序列片段；(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；(3)提取样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；(4)分析PCR扩增中焦磷酸；(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该微生物及其含量。其中，步骤(1)中所述的特征核酸序列片段为需要检测的微生物唯一具有、其它生物中不具有、并且通过公用数据库可以获得的核酸序列信息。步骤(3)中所述PCR扩增是特异的，只扩增步骤(1)中特征核酸序列片段，不扩增其它序列片段。步骤(4)中所述分析PCR扩增中焦磷酸是通过焦磷酸化学发光分析法，直接分析PCR产物中的总焦磷酸来实现的。所述焦磷酸化学发光分析法通过采用焦磷酸检测试剂盒来实施或通过配制的化学发光试剂来实施。所述焦磷酸检测试剂盒为SIGMA-ALDRICH公司的焦磷酸检测试剂盒。进一步地，所述配制的化学发光试剂主要成份为：0.01～0.5MTris-acetate(pH7.7),10～50mMEDTA,1～5mMMg(Ac)2，0.02％～0.1％牛血清白蛋白(BSA)，1～5mM二硫苏糖醇(DTT)，10～50mM5'-磷酰硫酸(APS)，0.2～1.0mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，2～10mM荧光素(D-luciferin)，50～800mM荧光素酶。通常为0.01MTris-acetate(pH7.7),20mMEDTA,1mMMg(Ac)2，0.02％牛血清白蛋白(BSA)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM5'-磷酰硫酸(APS)，0.4mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，4mM荧光素(D-luciferin)，800mM荧光素酶。进一步地，所述焦磷酸化学发光分析法中光信号的检测抗原用光电二极管或者电荷耦合元件(CCD)；可以单个检测，也可以并行检测。其中，步骤(5)中所述确定样本中是否含有该微生物是通过设定的焦磷酸CV值来判断的：焦磷酸分析信号强度大于CV值判定为有、与之对应为样本中是含有该微生物，小于CV值判定为无、与之对应为样本中是不含该微生物；步骤(5)中所述确定样本中该微生物含量的定量分析是指先通过一系列该微生物已知浓度经过步骤(1)—(5)，建立浓度与信号强度的关系曲线后，再分析样本得到的信号强度，从关系曲线上求得该微生物具体浓度。本专利技术基于PCR过程中产生数百倍于DNA量的焦磷酸用于判断最终PCR反应是否发生、以及反应程度，同时倒推出参与PCR反应的样本中是否含有某种微生物及其含量。由于焦磷酸检测是成熟的技术，市场上有相应的试剂盒出售(SIGMA-ALDRICH公司等)。因此，只需构建一个简单的光信号检测装置就可以实现对焦磷酸的定量分析。有益效果：现有技术相比，本专利技术是直接检测PCR过程中产生的大量焦磷酸，来判断PCR反应是否发生；而现在技术公开的是焦磷酸测序技术，是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据检测的病原微生物，从数据库中检索出一段代表该微生物的特征核酸序列片段；(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；(3)提取样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；(4)分析PCR扩增中焦磷酸；(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该微生物及其DNA浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据检测的病原微生物，从数据库中检索出一段代表该微生物的特征核酸序列片段；(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；(3)提取样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；(4)分析PCR扩增中焦磷酸；(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该微生物及其DNA浓度。2.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的特征核酸序列片段为需要检测的微生物唯一具有、其它生物中不具有、并且通过公用数据库可以获得的核酸序列信息。3.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增是特异的，只扩增步骤(1)中特征核酸序列片段，不扩增其它序列片段。4.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述分析PCR扩增中焦磷酸是通过焦磷酸化学发光分析法，直接分析PCR产物中的总焦磷酸来实现的。5.根据权利要求4所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述焦磷酸化学发光分析法通过采用焦磷酸检测试剂盒来实施或通过配制的化学发光试剂来实施。6.根据权利要求5所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，所述焦磷酸检测试剂盒为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，周东蕊，陈玲，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32