白介素-11融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含与清蛋白（包括但不限于清蛋白片段或变体）融合的、表现血小板生成或抗炎特性的白介素１１（ＩＬ－１１）（包括但不限于其片段及变体）的蛋白质。这些融合蛋白在本发明专利技术中统称为“本发明专利技术清蛋白融合蛋白”。这些融合蛋白表现出延长的保质期和／或药物动力学特性和／或延长的治疗活性。本发明专利技术包括治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药学组合物、制剂和试剂盒。本发明专利技术还包括编码本发明专利技术清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和／或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。本发明专利技术还涉及用于治疗或预防血小板减少症或炎性疾病的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于治疗或预防血小板减少症、冯维勒布兰德氏病(vWD)或炎性疾病诸如炎性肠病(IBD)的新型组合物。
技术介绍
白介素11(IL-11)的生理学功能白介素-11(IL-11)是促进巨核细胞生成及血小板生成的造血细胞因子，其作用途径是通过刺激原始干细胞、多能及定向祖细胞增殖(与其它造血生长因子像IL-3、IL-6、GM-CSF协同作用)导致巨核细胞成熟和血小板生成增加。由于上述活性，它具有刺激红细胞生成的副作用，但对嗜中性粒细胞增殖几乎没有影响。它还对肠粘膜细胞具有营养作用。另外，IL-11通过肝细胞诱导急性期蛋白(铁蛋白、触珠蛋白、CRP、纤维蛋白原)分泌。它还通过抑制巨噬细胞及T细胞效应物功能表现出抗炎特性。它抑制体外活化的巨噬细胞产生TNFα、IL-1β、IL-12、IL-6及NO。在生理学上，IL-11由多种基质细胞产生，像成纤维细胞、上皮细胞、软骨细胞及成骨细胞。在正常个体中，通常在血浆中无法检测到IL-11。IL-11的降解和清除还不太清楚。IL-11的生物化学性质IL-11是由178个氨基酸(AA)组成的19kDa的多肽，加上21个氨基酸的分泌前导序列，不含潜在的糖基化残基、二硫键或其它翻译后修饰，与IL-6相近似。它与含有IL-11特异的α受体亚基及混杂的(promiscuous)β亚基的多亚基受体复合体(gp130)结合。重组人IL-11(Genetics Institute/Wyeth的Oprelvekin，Neumega_)是在大肠杆菌中产生的缺少氨基末端脯氨酸的2-178位氨基酸的IL-11。这可能是从宿主细胞完成分泌所必需的，但据报道不会影响细胞因子的活性。化学疗法诱导的血小板减少症血小板减少症是因为恶性肿瘤接受长期或攻击性化学疗法的患者的一个严重问题。有些化学治疗剂诸如碳铂(Carboplatin)，表现出显著的、剂量限制性的毒性，并累积作用。目前，输注血小板是血小板减少症的标准治疗方法。然而，输注血小板是昂贵的，并具有同种异体免疫及血源性疾病传播的严重危险。大约5％-30％的输注血小板通常与发热性、非溶血性反应有关。另外，血小板是有限的资源，且保质期仅为5天。因此，为了预防或治疗血小板减少症，促进血小板生成的试剂是输注血小板的诱人替代方法。重组人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)于1997年在美国批准用于化学疗法诱导的血小板减少症的次级预防。其它潜在适应症包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、银屑病(牛皮癣)及冯维勒布兰德氏病(von Willebrand’s disease)。IL-11与清蛋白融合的预期优点血小板减少症的安全且有效治疗仍是未得到满足的医学需要。重组人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)的人体半衰期非常短，为6.9小时，同时治疗窗狭窄。通过融合清蛋白来延长血浆半衰期及提高生物利用度，预期可导致安全性与功效模式得到改进。这意味着可以通过较低剂量和/或较长服药间隔达到并维持治疗性血浆水平，同时避免了毒性阈值以上的峰水平。目前，Neumega_是用于治疗化学疗法诱导的血小板减少症唯一获得批准的药物，这表明此领域具有很大的未满足的医学需要。Neumegad_显示出高发生率的毒性作用，诸如水肿及心血管功能紊乱，连同低效能，尤其是在血小板减少症的严重病例中。
技术实现思路
本专利技术涉及包含与清蛋白或其片段或变体融合的IL-11的蛋白质。所述融合蛋白在本专利技术中统称为“本专利技术清蛋白融合蛋白”。与未融合的IL-11相比，这些本专利技术融合蛋白表现出延长的体内半衰期和/或延长的治疗活性。本专利技术包括治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂及试剂盒。本专利技术还包括编码本专利技术清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。本专利技术还涉及用于治疗和预防血小板减少症的组合物和方法。本专利技术还涉及抗炎治疗及预防的组合物和方法。另外，本专利技术涉及用于治疗和预防冯维勒布兰德氏病的组合物和方法。附图简要说明附图说明图1将rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白静脉内施用于兔后的IL-11血浆浓度。图2将rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于兔后的IL-11血浆浓度。图3将rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白静脉内施用于大鼠后的IL-11血浆浓度。图4将rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于大鼠后的IL-11血浆浓度。图5用IL-11处理首次进行实验的大鼠后的血小板水平变化过程。图6用IL-11处理接受化疗的大鼠后的血小板水平变化过程。图7小鼠IBD模型应用IL-11后的体重变化(按基线的％)。图8小鼠IBD模型应用IL-11后的目测评分(腹泻及显著直肠出血)。图9小鼠IBD模型应用IL-11后的结肠长度。图10小鼠IBD模型应用IL-11后的组织学疾病评分。图11本专利技术的各种化合物的SDS凝胶及Western印迹。本专利技术的详细说明本专利技术涉及包含与IL-11偶联的清蛋白的融合蛋白。这样的肽包括但不限于与gp130受体复合体结合的肽。这些肽包括具有血小板生成或抗炎特性的IL-11或其片段或变体。本专利技术使用的术语“蛋白质”及“肽”为非限制性的，包括蛋白质和多肽以及肽。另外，可以将化学实体与本专利技术的融合蛋白共价附着或融合或者联合使用，用于增强生物学活性或调节生物学活性。本专利技术清蛋白融合蛋白预期可延长IL-11的体内半衰期。所述融合了清蛋白的肽/蛋白质的体外或体内半衰期较未连接清蛋白的肽/蛋白质的半衰期延长了2倍，或5倍，或更多。另外，预期本专利技术清蛋白融合蛋白可降低治疗性肽的服药频率。与未连接清蛋白的治疗性肽的服药频率相比，服药频率降低了至少1/4，或至少1/2，或更多。预期本专利技术清蛋白融合蛋白可在体外和/或体内延长肽的保质期，和/或稳定肽和/或其在溶液中(或于药物组合物中)的活性。这些清蛋白-融合蛋白，可以为治疗剂，预期可减少这样一种需要，即为预防诸如非特异性结合等因素引起的蛋白质损失而使用大大过量的载体蛋白(诸如未融合的清蛋白)来配制蛋白质溶液。半衰期延长定义为根据下述实施例4在6月龄雄性Wistar大鼠皮下注射后的第一个24小时测量到的半衰期较未融合IL-11化合物至少高2倍(优选至少高5倍、10倍、20倍或30倍)。本专利技术还包括编码清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。本专利技术还包括转基因生物体，该转基因生物体经修饰后含有本专利技术的核酸分子，该核酸分子任选经修饰后表达由该核酸分子编码的清蛋白融合蛋白。本专利技术还包括包含本专利技术清蛋白融合蛋白及药学可接受稀释剂或载体的制药学制剂。这样的制剂可以存放在试剂盒或容器中。这样的试剂盒或容器可以与关于保质期延长的蛋白质的说明书一起包装。这样的制剂可用于预防、治疗、改善患者诸如哺乳动物或人的血小板减少症或炎性疾病诸如炎性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、冯维勒布兰德氏病等或是相关紊乱的方法，包括将制药学制剂施用于患者的步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含ＩＬ－１１或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体的清蛋白融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M克罗兹，G迪克尼特，汉斯彼得豪泽，T韦默，达雷尔斯利普，
申请(专利权)人：达尔塔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]