生产大豆异黄酮的方法技术

本发明专利技术涉及一种农业技术领域的生产大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气消毒，而后将大豆种脐向下接种到萌发培养基中，得到大豆无菌苗；第二步，农杆菌侵染：用经过活化的发根农杆菌侵染第一步中得到的大豆无菌苗的不同部位，待侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于扩大繁殖培养基中生长；第三步，大豆异黄酮的提取：用从第二步得到的发根中提取大豆异黄酮。本发明专利技术解决了从胚芽中提取大豆异黄酮虽然含量高，但生物量小的限制，因此可以达到高效生产大豆异黄酮的效果。

Process for producing soybean isoflavone

The invention relates to a method for the field of agricultural technology production of soybean isoflavones, which comprises the following steps: the first step, soybean seedlings from mature soybean seeds, disinfected with chlorine, then inoculated into soybean. Down the germination medium to obtain soybean sterile seedling; the second step: after Agrobacterium infection different parts of the activation of Agrobacterium infection the first step in the soybean sterile seedlings, to infect long hairy roots, cut the roots, expand propagation medium on growth; the third step, the extraction of soybean isoflavones from soybean isoflavone extraction with second step root. The invention solves the limitation that the soybean isoflavone extracted from the germ has the advantages of high content but small biomass, so the effect of producing soybean isoflavone can be effectively achieved.

【技术实现步骤摘要】
生产大豆异黄酮的方法
本专利技术涉及一种农业
的方法，具体涉及一种生产大豆异黄酮的方法。
技术介绍
大豆异黄酮(soybeanisoflavones)是大豆在生长过程中形成的次级代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮为多酚类化合物，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少，80％-90％的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1％-0.3％。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1％-2％，但由于胚只占种子总重量的2％，因此尽管浓度很高，所占比例却很少(10％-20％)。大豆异黄酮是大豆中一类非常重要的非营养成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨质疏松、类似雌性激素的作用。目前国内外主要采用直接从大豆中提取异黄酮、从大豆加工后的中间产物、废弃物中提取异黄酮，以及用分解与合成的方法生产大豆异黄酮。目前大多数的研究专利是直接从大豆粉、豆粕中提取大豆异黄酮。由于大豆的子叶及胚轴的异黄酮含量较高，尤其是萌发大豆的胚轴中大豆异黄酮含量很高。经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号02114991.7，专利技术名称为萃取大豆异黄酮的方法，该专利提出涉及一种通过大豆种子萌动期分离大豆胚轴供萃取大豆异黄酮的方法。但这种方法是将成熟饱满的大豆种子，经冷水浸泡萌动至初始萌芽状态，经脱皮、大豆子叶分瓣、子叶与大豆胚轴分离的方法得到胚芽，只有新鲜的能够萌发的大豆种子才能通过这种方法获得活的，可以生长的大豆胚芽。而且一粒大豆种子，只有一个胚芽，但胚芽在一粒种子中所占的重量比很小，占大豆总重量的2％～2.5％。一粒新鲜的种子经过这种方法去掉胚芽之后，拨掉的子叶必须马上进行加工处理，否则就会很快变质，失去加工价值，造成浪费。因此，尽管胚芽中大豆异黄酮的含量很高，是子叶中地8～10倍，但由于胚芽的获得及产量十分有限，因此采用这种方法生产大豆异黄酮也受到很大的限制。利用大豆高含异黄酮部位(如下胚轴，胚芽，以及萌动的大豆种子)提取大豆异黄酮，已成为提高大豆异黄酮生产效率的有效途径。但现有方法都是利用大豆植物体本身，取其中含量较高的部位生产和提取大豆异黄酮。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提出一种生产大豆异黄酮的方法。本专利技术不是利用在自然状态下的大豆种子，萌发的大豆种子，以及大豆种子的某一部分用于异黄酮的提取，而是利用发根农杆菌感染大豆幼苗(无菌苗)，使之产生发根，再通过发根的增殖及扩大培养，生产发根，供大豆异黄酮的提取及生产使用，解决了从胚芽中提取大豆异黄酮虽然含量高，但生物量小的限制，因此可以达到高效生产大豆异黄酮的效果。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括以下步骤：第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气或过饱和漂白粉精片溶液进行大豆种子灭菌，而后将大豆种子种脐向下接种到萌发培养基上，经过培养得到大豆无菌苗，为“第二步”发根农杆菌的侵染提供植物受体材料。所述萌发培养基为MS培养基，B5基本培养基，或MS培养基的无机成分加上B5培养基的有机成分，在温度为24℃-26℃条件下培养7-10天。第二步，农杆菌侵染：用经过活化的发根农杆菌侵染在“第一步”中得到的大豆无菌苗的不同部位，包括下胚轴，子叶节，子叶，真叶及根等部位。接种方法采用常规的农杆菌侵染方法，以及针刺胚轴，子叶节，子叶及真叶，根等部位的方法，也可以采用下胚轴切段，农杆菌侵染的方法。待被侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于扩大繁殖培养基中生长。所述扩大繁殖培养基，为MS固体、液体培养基，或B5液体、固体培养基，培养温度为24℃-26℃。为第三步的大豆异黄酮提取及不同成分的含量测定提供植物材料。第三步，大豆异黄酮的提取：用乙醇从第二步得到的发根中提取大豆异黄酮。所述乙醇，其体积浓度为70％-80％。经紫外分光光度计法检测发根中大豆异黄酮的不同成分及含量，测定发根中大豆异黄酮的含量远远高于相同培养条件下正常大豆根系中异黄酮的含量，是正常生长的对照根的4-10倍。同时发根中异黄酮的含量也高于相同培养条件及田间自然生长条件下大豆植物体任何部位中的异黄酮含量，包括公认异黄酮含量最高的下胚轴部位。因此利用发根农杆菌侵染大豆产生发根，再通过发根的扩大培养，可以达到高效产生大豆异黄酮目的。大豆发根中大豆苷元等的含量是大豆正常组织的4-10倍，并且发根有可以无限增殖的优点。大豆的胚芽也有很高的异黄酮含量，但每一粒大豆种子只有一个胚芽，而且萌动后胚芽仅仅占大豆总量的2-2.5％，因此使大豆胚芽生产大豆异黄酮的产量和效率是有限，而使用发根培养的方法可以得到高异黄酮含量的发根，通过发根的扩大培养，解决了从胚芽中提取大豆异黄酮虽然含量高，但生物量小的限制，因此可以达到高效生产大豆异黄酮的效果。本专利技术可用于以大豆为材料的大豆异黄酮生产，同样也可以用于其它豆科植物材料(如野生及多年生野生大豆等)。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例11.选择优质大豆品种，取健康、成熟的大豆种子，用氯气消毒2小时-10小时，将大豆种脐向下接种到B5固体培养基中，培养基的pH为5.8。接种在培养基上的大豆种子在24℃-26℃条件下培养7天，得到健康的大豆无菌苗。2.取大豆无菌苗，用活化后的发根农杆菌侵染无菌苗的易感部位。待侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于MS固体培养基上，在25℃条件下培养15-20天。3.取出发根，打碎研磨，用70％的乙醇提取，以0.5g样品，5ml乙醇的配比进行提取，将提取后的溶液再稀释100倍，用紫外分光光度计分别在250及260nm处测定提取液的吸光度。选择吸光值对应浓度高于对照根的样品(发根)，记录，标号进行扩大培养，得到大量发根用于大豆异黄酮的提取。发根中大豆异黄酮的含量是正常大豆根的4倍-10倍。实施例21.选用高产大豆品种东农42，挑选饱满，无病虫害的当年大豆种子，用漂白粉精片过饱和溶液浸泡大豆种子15分钟，再用无菌水漂洗3次，将种子接种到固体B5基本培养基上，B5基本培养基的Ph值为5.8，在25℃条件下培养10天，得到无菌苗，取活化农杆菌接种无菌苗子叶或下胚轴。具体做法为：用手术刀轻轻割破子叶及下胚轴表皮，将农杆菌涂抹伤口处。两周后在伤口处长出发根，切下发根，用抗生素除菌，或在B5基本培养基中加入抗生素，达到除菌的目的。将除菌完全的发根转接到B5固体培养基上进行发根培养。得到发根中大豆异黄酮的含量是对照根的4倍-10倍。实施例3选用高产大豆品种合丰35，挑选饱满，无病虫害的当年大豆种子，用氯气灭菌2小时-24小时，将灭菌的种子接种到MS无机成分加上B5的有机成分所组成的固体培养基上，培养基的Ph值为5.8，在25℃条件下培养7天-10天，得到无菌苗。切取无菌苗的下胚轴，取活化农杆菌涂抹在无菌苗下的胚轴切段的切面上。1周-2周后在伤口处长出发根。切下发根，置于添加抗生素的培养基中进行抑菌培养。除菌完全之后，转接到MS液体培养基中培养发根。得到发根中大豆异黄酮的含量是对照根的4倍-10倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产大豆异黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气消毒，而后将大豆种脐向下接种到萌发培养基中，得到大豆无菌苗；

【技术特征摘要】
1.一种生产大豆异黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，大豆无菌苗的获得：取成熟的大豆种子，用氯气消毒，而后将大豆种脐向下接种到萌发培养基中，得到大豆无菌苗；第二步，农杆菌侵染：用经过活化的发根农杆菌侵染第一步中得到的大豆无菌苗的不同部位，待侵染部位长出毛状发根后，切下发根，置于扩大繁殖培养基中生长；第三步，大豆异黄酮的提取：用从第二步得到的发根中提取大豆异黄酮。2.根据权利要求1所述的生产大豆异黄酮的方法，其特征是，所述大豆无菌苗的获得，其中的萌发培养基为MS培养基，B5基本培养基，或MS培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文君，夏天雨，
申请(专利权)人：重庆泰升生态农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50