烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法技术

本发明专利技术提供烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC‑MS/MS检测方法：包括以下步骤：（1）样品处理：称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3‑5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。取烟叶样品提取液5μL进样UPLC‑MS/MS分析，或样品稀释100倍摇匀后取5μL进样UPLC‑MS/MS分析；（2）按照一定条件进行UPLC‑MS/MS检测；（3）根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的浓度。本发明专利技术的有益效果是UPLC‑MS/MS检测方法检测烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合对烟草中生物碱类物质进行分析，以探索这些对人体的影响及质量控制。

UPLC MS/MS method for the determination of nicotine, nornicotine and nitrosonornicotine concentration

The invention provides a method for the detection of MS/MS UPLC nicotine, nornicotine and nitrosonornicotine concentration, which comprises the following steps: (1) sample preparation: weigh tobacco powder samples to a 10mL volumetric flask, adding 3 methanol 5ml extraction, ultrasonic, and then methanol volume to scale, shake the supernatant after. The film, have tobacco sample extract. Take samples of tobacco leaf extract 5 L sample UPLC MS/MS analysis, or the sample was diluted 100 times after 5 L strain analysis sample UPLC MS/MS; (2) UPLC MS/MS detection in accordance with certain conditions; (3) according to the regression equation of the standard curve of the peak area and the sample concentration calculation in tobacco nicotine, nornicotine and nitroso reduction of smoke. The invention has the beneficial effects of UPLC MS/MS detection method in human urine nicotine, nornicotine and nitroso reduced smoke concentration, simple and quick, high sensitivity, strong anti-interference ability, suitable for alkaloids in tobacco were analyzed to explore these effects on human health and quality control.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分析领域，尤其是涉及一种烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法。
技术介绍
烟草中的生物碱主要以有机酸盐和无机酸盐的形式存在,主要有烟碱、降烟碱和新烟碱等。烟碱(又名尼古丁,nicotine)是烟草中生物碱的主要成分,在烟草中的含量一般为1％～2％,占烟草生物碱的95％,是导致人吸烟上瘾的主要因子。其化学名称为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷[1～2]。烟碱也是烟气中最主要的生物碱,是主流烟气中具有毒性的粒相成分,中等剂量的烟碱能使人呼吸加快、血管舒张和呕吐明显加剧,稍高剂量的烟碱可引起震颤和痉挛。烟碱固然有害,但也有某些益处,如可使人得到安慰和快感,解除焦虑,调节情绪,平息激动和烦燥,增强记忆和技巧,降低肥胖的食欲,在脑内可模拟乙酰胆碱的作用,从而减轻帕金森综合症和老年性痴呆症等。因此,烟碱是评价烟叶品质的主要指标,也是衡量烟气质量的主要指标。烟碱及其代谢物含量的高低不仅影响烟叶、烟制品和相关产品(如烟草香料、农药等)的质量,还关系到人体健康。所以,很多研究者不仅对烟草、卷烟、总粒相物和农药中的烟碱进行测定,而且还对唾液、头发、血液、尿、空气等中的烟碱及其代谢物的含量进行分析,以探索烟碱对人体的影响。N-亚硝基降烟碱(NNN)，NNN是发现最早的一个烟草特有亚硝胺，并且在1977年报道了烤烟品Coker139中的NNN的平均含量为1.31mg/kg。烟草特有亚硝胺有致癌性，N-亚硝基降烟碱NNN致癌性最为强烈。所以对烟草中NNN的检测尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的烟碱、降烟碱和亚硝基降烟浓度检测方法，尤其适合对烟草中对烟碱、降烟碱和亚硝基降烟浓度的检测。本专利技术的技术方案是：烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法：(1)样品处理：称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，此时由于烟碱成分含量高，测定时，在烟碱出峰时间段不进行质谱采集。样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于烟碱含量测定。(2)HPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：流动相：A:水，用氨水调pH至11.0B:甲醇流速：0.3ml/min进样量：5μL柱温：45℃色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1.梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.510904.010904.019556955表2.质谱条件其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s(3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟的浓度。为了取得更好的技术效果，制作标准曲线时所用标准溶液的制备：烟碱系列溶液配制：将烟碱标准品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的标准品母液，用稀释液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。混合标准品母液配制：取降烟碱和亚硝基降烟碱的母液，用稀释液配制成100μg/mL的混合标准品母液，用稀释液(甲醇/水＝1/1，V/V)配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。步骤(1)中样品的处理方法：称取烟叶样品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。表3三化合物定量检测线性与范围本专利技术具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测人尿中对羟基苯甲酸酯类浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合多种食用防腐添加剂的同时定性定量检测，为食品行业中食品中防腐添加剂的监管提供了技术支持。附图说明图1是空白溶剂色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱，烟碱、降烟碱的色谱图。图2是2ng/ml的三化合物混合标准溶液色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.71min)，烟碱(RT＝2.54min)、降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。图3是26号样品(不采集烟碱质谱信息)色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，烟碱(RT＝2.54min)，降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。图4是26号样品(稀释100倍)色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，烟碱(RT＝2.54min)、降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。具体实施方式实施例1从市场购买7种样烟叶作为检测样品，对其进行编号分别为1号，2号，3号，26号，3-17号，A2-2号，W1号，按照
技术实现思路
中的方法对其进行检测，即：称取烟叶样品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC-MS/MS分析，用于烟碱含量测定。在样品进样分析前，标准曲线制备时需要先扣除空白溶剂的量，空白溶剂色谱图见图1。每种物质扣除空白溶剂后得标准曲线，见表3。然后将2ng/ml的标准品混合，进样分析，三种化合物混合标准品进样分析色谱图见图2。7种样品进样分析后结果见表4。图3为其中26号样品的样品不稀释的色谱图，此图中，亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，降烟碱(RT＝2.07min)，图4为26号样品稀释100倍的色谱图，此图中烟碱的RT＝2.54min。表4烟叶样品中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定结果ND表示为：未检测到实施例22.1定量限检测对烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱的定量限和检测限是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的贮备液稀释至低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，算出可能被可靠的检测出的最低浓度或百分比。要求：定量限信噪比不低于10，测定6次峰保留时间的相对标准差应不大于2.0％，峰面积的相对标准差应不大于10.0％。定量限试验：取烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱适量，精密称定，分别用乙腈/水＝1/1，V/V，甲醇/水＝1/1，V/V稀释制成每1ml中含烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱0.5ng的溶液，精密量取该溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，平行测定6次。结果表5。表5定量限试验结果结论定量限试验：重复测定6次，烟碱保留时间RSD为0.301％，本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC‑MS/MS检测方法：其特征在于：包括以下步骤：(1)样品处理：称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3‑5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液；样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC‑MS/MS分析，主要用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，此时由于烟碱成分含量高，测定时，在烟碱出峰时间段不进行质谱采集；样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC‑MS/MS分析，主要用于烟碱含量测定；(2)HPLC‑MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：流动相：A:水，用氨水调pH至11.0 B:甲醇流速：0.3ml/min 进样量：5μL柱温：45℃色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18,1.7μm,2.1*50mm Column表1.梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.510904.010904.019556955表2.质谱条件其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s(3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟的浓度。...

【技术特征摘要】
1.烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法：其特征在于：包括以下步骤：(1)样品处理：称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液；样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，此时由于烟碱成分含量高，测定时，在烟碱出峰时间段不进行质谱采集；样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于烟碱含量测定；(2)HPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：流动相：A:水，用氨水调pH至11.0B:甲醇流速：0.3ml/min进样量：5μL柱温：45℃色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1.梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.510904.010904.019556955表2.质谱条件其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s(3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟的浓度。2.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：付淑军，石小娜，王鹏，
申请(专利权)人：瀚盟测试科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12