一种可用于电化学实时PCR的芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可用于电化学实时PCR的芯片及其制备方法，在基片上生长绝缘层，然后制作三电极，包括工作电极、辅助电极和参比电极；接着在工作电极表面生长绝缘薄膜，通过光刻工艺和腐蚀工艺将微阵列电极的掩膜版图形转移到绝缘薄膜上；再在工作电极上腐蚀掉绝缘薄膜的区域生成微阵列电极。每个微阵列电极就是一个独立反应单元，用于电化学实时PCR反应。本发明专利技术的芯片可通过串联或并联方式联用，同时进行很多PCR反应，大大提高检测通量，具备高精度、高通量、低浓度定量检测的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物芯片研究领域，特别涉及一种可用于电化学实时PCR的芯片及其制作方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于病原体检测、产前诊断、肿瘤基因检测、疗效评估、食品安全检测、食品转基因检测等医疗、食品、卫生领域。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。而且凝胶电泳需要开盖检测，极易造成PCR产物的污染。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)，在PCR扩增过程中，通过添加荧光物质，对PCR进程进行实时检测，有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。荧光定量PCR仪由基本PCR部分、荧光检测部分和上位计算机部分等组成，其中荧光检测部分包括激励光源、光电倍增管、信号采集与处理等部分，因此设计复杂、机体庞大、成本较高，难以基层推广使用。电化学芯片为PCR检测提供了一种有效方法，无需使用特定光源，不必进行光电转化倍增等步骤，因此简单易行，易于实现仪器小型化和便携化。电化学芯片研究已开展多年，但目前大部分电化学芯片都是在PCR扩增完成之后，将扩增产物加入到芯片中，根据阴阳性样本给出的不同电信号进行判断，一方面操作繁琐，不能实现实时监测，另一方面PCR产物的开盖操作大大增加了污染的可能性。因此电化学芯片虽然具备一系列优点，但尚未实现大规模使用。电化学实时PCR近年来在文献中已有报道，Thibaut等利用在反应体系中加入杂交指示剂，实时监测PCR扩增过程中循环方波伏安曲线，在有模板存在的情况下，随着PCR扩增的进行，循环方波伏安曲线的峰值电流逐渐降低(ThibautDeféveretal.Real-TimeElectrochemicalPCRwithaDNAIntercalatingRedoxProbe.Anal.Chem.,2011,83(5),pp1815–1821)。该方法不涉及引物/探针的修饰，对反应电极的设计和加工没有特殊要求。为了增加电化学实时PCR的特异性，可考虑通过在引物/探针上引入电化学活性官能团，实时监测PCR体系的扩增情况。但是，现有技术中还没有可进行电化学实时PCR的芯片。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种设计合理、加工精密的芯片，用于电化学实时PCR检测，并提供一种该芯片的制备方法，要求制备简单，成本低廉，可批量化生产。本专利技术的技术方案如下：一种用于电化学实时PCR的芯片，包括基底、基底正面的绝缘层，以及位于绝缘层上的三电极，所述三电极是工作电极(WE)、辅助电极(CE)和参比电极(RE)，其特征在于，所述工作电极表面覆盖有绝缘薄膜，在绝缘薄膜中排布有微阵列电极，各微阵列电极的下面连接工作电极，而侧面通过绝缘薄膜彼此隔开。从上述芯片的表面看，微阵列电极的阵列排布可以是平行排布、交叉排布、圆形排布等；所述微阵列电极上表面的形状可以为圆形、矩形、环形、正多边形等形式。优选的，所述微阵列电极的上表面至少有一维尺寸在1～100μm范围内(对于圆形而言，所述一维尺寸即指其直径大小)；从上表面看，所述微阵列电极的一维尺寸与相邻微阵列电极的间距之比为1:1～1:20。所述基底可以是硅、玻璃、聚合物等材料的基片，优选为硅片。所述基底正面的绝缘层材料可以是二氧化硅(SiO2)、三氧化二铝(Al2O3)、二氧化锆(ZrO2)等。三电极和微阵列电极的材料可以为金、银、铂、铬、碳等。三电极形貌可以是平面式也可以是圆柱式，所述平面式的形状可以是圆形、环形、正多边形等。本专利技术芯片，可通过串联或并联方式联用，同时进行数个PCR反应，大大提高检测通量。本专利技术还提供了上述用于电化学实时PCR的芯片的制作方法，包括如下步骤：1)清洗基底并干燥，然后在基底上生长绝缘层；2)在绝缘层上制作三电极、电极引线和引线接口，所述三电极包括工作电极(WE)、辅助电极(CE)和参比电极(RE)；3)在工作电极表面生长绝缘薄膜；4)通过光刻工艺和腐蚀工艺将微阵列电极的掩膜版图形转移到步骤3)生长的绝缘薄膜上；5)在工作电极上腐蚀掉绝缘薄膜的区域生成微阵列电极。上述步骤1)基底可以是硅、玻璃、聚合物等材料的基片，优选为硅片。可以采用有机溶剂和水对基底进行超声清洗，去除基底表面的有机杂质；可以使用无机酸和双氧水的混合液加热煮沸基底，然后用去离子水冲洗，去除基底表面的无机杂质。清洗后的基底用氮气吹干，之后于真空干燥箱内烘干。步骤1)在基底上生长的绝缘层材料和生长厚度依据绝缘性能和成本而定。绝缘层材料可选自二氧化硅(SiO2)，三氧化二铝(Al2O3)，二氧化锆(ZrO2)等；生长绝缘层的方法包括物理气相沉积法、化学气相沉积法、热氧化法等，优选热氧化法。步骤2)通过光刻工艺和蒸镀工艺，在绝缘层上制作电极、电极引线以及引线接口。首先通过光刻工艺在绝缘层上光刻出需要的图形，光刻胶作为掩膜，可以使用正胶，也可以使用负胶；然后通过蒸镀工艺，在图形区蒸镀金属，形成电极，最后剥离掉掩膜。对于硅片，由于金属电极与二氧化硅的粘附性不好，可以先蒸镀一层钛或锆的金属缓冲层，起到粘附缓冲作用，之后将电极对应的金属蒸镀到金属缓冲层上。电极材料可以为金、银、铂、铬、碳等，电极材料可以和电极引线以及引线接口的材料一致，也可以不同。三电极形貌可以是平面式，也可以是圆柱式，其中平面式的形状可以是圆形、环形、弧形、正多边形等，如图2所示，其中工作电极(WE)为圆形，辅助电极(CE)和参比电极(RE)为弧形，设置在圆形工作电极的外围。步骤3)在工作电极表面生长的绝缘薄膜用以微阵列电极的绝缘。生长该绝缘薄膜的方法为化学气相沉积法，采用该方法形成的薄膜颗粒较小且厚度均匀。该绝缘薄膜的材料可选自SiO2、Al2O3、ZrO2等。步骤4)在工作电极表面的绝缘薄膜上涂覆一层光刻胶，通过光刻工艺光刻出需要的图<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于电化学实时PCR的芯片，包括基底、基底正面的绝缘层，以及位于绝缘层上的三电极，所述三电极是工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，所述工作电极表面覆盖有绝缘薄膜，在绝缘薄膜中排布有微阵列电极，各微阵列电极的下面连接工作电极，而侧面通过绝缘薄膜彼此隔开。

【技术特征摘要】
1.一种用于电化学实时PCR的芯片，包括基底、基底正面的绝缘层，以及位于绝缘层上的
三电极，所述三电极是工作电极、辅助电极和参比电极，其特征在于，所述工作电极表面
覆盖有绝缘薄膜，在绝缘薄膜中排布有微阵列电极，各微阵列电极的下面连接工作电极，
而侧面通过绝缘薄膜彼此隔开。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述微阵列电极为平行排布、交叉排布或圆形排
布；所述微阵列电极上表面形状为圆形、环形或正多边形。
3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述微阵列电极的上表面至少有一维尺寸在
1～100μm范围内；从上表面看，所述微阵列电极的一维尺寸与相邻微阵列电极的间距之比
为1:1～1:20。
4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述基底材料为硅、玻璃或聚合物；所述绝缘层
材料为二氧化硅、三氧化二铝或二氧化锆；所述三电极和微阵列电极的材料为金、银、铂、
铬或碳。
5.一种用于电化学实时PCR的芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)清洗基底并干燥，然后在基底上生长绝缘层；
2)在绝缘层上制作三电极、电极引线和引线接口，所述三电极包括工作电极、辅助电极
和参比电极；
3)在工作电极表面生长绝缘薄膜；
4)通过光...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆祖宏，李清宁，李成强，严勇，魏颖颖，孙利，王磊，孙杰，
申请(专利权)人：北京大学，北京普若博升生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11