人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。本发明专利技术所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。
技术介绍
炭疽杆菌(Bacillusanthraci)属于芽孢杆菌属，是人畜共患急性传染病炭疽的病原体。人和动物通过直接或间接接触炭疽杆菌引起皮肤、肺或肠道感染，常并发败血症。牛羊的发病率最高，人常因屠宰、食用或与病死畜接触而感染。炭疽杆菌具有很强的致病性、传染性和生存能力，是高致病性病原微生物，而且能够以芽孢形式长期保持生命力，一度是制造最具有杀伤力的生物武器的病原体，对社会公共卫生和经济发展的危害巨大。炭疽杆菌的传统检测方法通常包括染色镜检、分离培养、免疫学诊断、生理生化试验等。其中广泛使用的是免疫学诊断方法，但抗原和抗体的非特异性结合会导致免疫学检测结果的假阳性率较高而检测灵敏度较低。分离培养鉴定的结果准确性好，但实验过程繁琐，检测周期较长，不能适应现代公共卫生机构快速反应体系的需要。随着分子生物学技术的发展，基于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)原理的检测技术，针对炭疽杆菌特异基因进行扩增和检测，数小时内即可获得检测结果，而且在检测的特异性和灵敏度上均有较大提高，因而受到许多研究者的青睐。普通的PCR法检测方法每次只能检测一个基因，效率较低；用凝胶电泳对扩增产物进行分析时，容易造成污染。多重荧光PCR方法可在一次反应中检测多个基因，节约了时间和成本；用仪器来识别荧光信号，提高了检测灵敏度，减少了人工误差；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，大大降低了样本间交叉污染的风险。线粒体DNA是一种共价闭合环状DNA分子。在高等哺乳动物的单个细胞中，线粒体DNA分子的数量在数百乃至上万个。线粒体基因遗传稳定，进化速度快，不同物种间差异显著，常用作分子进化和系统发生学的遗传标记。根据人特异性的线粒体DNA保守区域设计引物进行PCR扩增，可以检测人源细胞的存在。由于线粒体基因的高拷贝特性，此方法具有很高的灵敏度，可以在复杂样本中检测出含量极少的人源细胞。
技术实现思路
针对传统检测手段中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，炭疽杆菌基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述人线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。进一步优选地，所述人线粒体基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。本专利技术的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行炭疽杆菌基因、人线粒体基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断炭疽杆菌感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。基于本专利技术所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)。加入本专利技术的引物及探针、待检样本即可获得PCR反应体系。所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有炭疽杆菌特异性扩增片段的质粒或含有人线粒体基因特异性扩增片段的质粒。优选地，炭疽杆菌特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。优选地，人线粒体基因特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等。本专利技术的第二方面，提供了前述人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针；(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；(4)PCR反应结束后，分析结果。步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃2min；(b)94℃2min；(c)93℃5sec；(d)60℃30sec；步骤(c)-(d)循环40次。本专利技术的第三方面，提供了前述试剂盒在制备炭疽杆菌检测产品中的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用多重荧光PCR法，设计了炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，可以在单个PCR反应管中同时检测2个基因，能够准确地检测炭疽杆菌的存在以及毒力强弱，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断炭疽杆菌感染情况提供了有力工具。本专利技术所采用的荧光PCR检测方法灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，所用引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，炭疽杆菌基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述人线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引
物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序列如
SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，炭疽杆菌基因
检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸序列如
SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述人线粒体
基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基
因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒
体基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针5’端标记
的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人线粒体基因检测探针5’端标记
的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄吉城，李小波，郑夔，师永霞，刘燕，王宁，王凯，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，上海之江生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44