生产色谱材料的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于生产色谱材料的方法。更确切地，本发明专利技术涉及一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，该方法包含以下步骤：在多孔碳水化合物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及一种用于生产色谱材料的方法。更确切地，本专利技术涉及一种通过色谱颗粒表面改性生产反相色谱(RPC)材料的方法。专利技术背景吸附色谱取决于溶质分子和化学接枝到色谱基体的特定设计的配体之间的化学相互作用。多年来，利用从电子电荷到生物亲和力的多种生化特性，已将许多不同类型的配体固定到色谱载体用于生物分子纯化。对用于生物分子制备色谱的吸附技术范围的一种重要补充是反相色谱，其中流动相溶质结合至固定的正烷基烃或芳族配体经由疏水性相互作用发生。反相色谱在生化分离和纯化领域内具有分析和制备两种应用。具有一定程度疏水特性的分子，例如蛋白质、肽和核酸，可通过反相色谱以优良的回收率和分解度分离。此外，流动相中的离子配对修饰剂允许带电溶质（例如完全脱保护的低聚核苷酸和亲水肽）的反相色谱。制备型反相色谱应用于从蛋白质片段微纯化用于测序到重组蛋白质产物的生产规模纯化。反相色谱的分离机制取决于流动相中的溶质分子和固定的疏水配体即固定相之间的疏水性结合相互作用。疏水性结合相互作用自身的实际特性是激烈争论的问题，但常规知识假定结合相互作用是有利的熵效应的结果。用于反相色谱的初始流动相结合条件主要为水性的，这表明在溶质分子和固定配体两者周围的高度组织化水结构。在溶质结合到固定的疏水配体时，暴露于溶剂的疏水面积最小化。因此，组织化水结构的程度随着相应的系统熵的有利增加而减小。以这种方式，从能量观点来看，疏水部分即溶质和配体缔合是有利的。反相色谱是实验设计的吸附方法，其依赖于影响分离的分配机制。溶质分子在流动相和固定相之间分配(即建立平衡)。溶质在两相之间的分布取决于介质的结合性质、溶质疏水性和流动相组成。初始，实验条件设计成有利于溶质从流动相吸附至固定相。随后，改变流动相组成以有利于溶质从固定相脱附回到流动相中。在这种情况下，认为吸附是溶质分子分布基本上100%在固定相内的极端平衡状态。相反地，脱附是溶质基本上100%分布在流动相内的极端平衡状态。生物分子反相色谱通常使用梯度洗脱而不是等度洗脱。虽然生物分子在水性条件下强烈吸附于反相基体表面，但它们在非常窄的有机修饰剂浓度窗内从基体脱附。连同这些具有其独特吸附性质的高分子量生物分子，典型的生物试样通常含有宽的生物分子混合物，具有相应多样化的吸附亲和力范围。因此，用于复杂生物试样反相分离的唯一实用方法为梯度洗脱。总之，反相色谱中的分离取决于具有不同程度疏水性的溶质分子对疏水固定相的可逆吸附/脱附。色谱过程中的第一步为在适合的初始流动相条件下使被反相介质填充的柱平衡，所述流动相条件为pH、离子强度和极性(流动相疏水性)。通过添加有机修饰剂例如乙腈来控制流动相的极性。离子配对剂例如三氟乙酸也可能是适当的。初始流动相(通常称为流动相A)的极性必须低得足以溶解部分疏水的溶质，但高得足以保证溶质结合到反相色谱基体。在第二步骤中，施用包含要分离的溶质的样品。理想地，将样品溶于用于使色谱床平衡的相同流动相中。以发生最优结合的流速将样品施用于柱。一旦施用样品，进一步用流动相A洗涤色谱床，以去除任何未结合和不需要的溶质分子。结合的溶质随后通过调节流动相的极性从反相介质脱附，使得结合的溶质分子连续脱附并从柱洗脱。在反相色谱中，这通常包括通过增加有机修饰剂在流动相中的百分比来降低流动相的极性。这通过维持最终流动相(流动相B)中有机修饰剂的高浓度来实现。通常，初始和最终流动相溶液的pH保持相同。通过从含有极少或没有有机修饰剂的100%初始流动相A到含有较高有机修饰剂浓度的100%(或更少)流动相B的增加线性梯度，实现流动相极性的逐渐下降(增加流动相疏水性)。根据其各自的疏水性，结合的溶质从反相介质脱附。过程中的第四步骤包括去除先前未脱附的物质。这通常通过将流动相B改变到接近100%有机修饰剂以保证在再使用柱之前完全去除全部的结合物质来实现。第五步骤是色谱介质从100%流动相B回到初始流动相条件的再平衡。反相色谱中的分离是由于存在于样品中的溶质的不同结合性质(因为它们疏水性质的差异)。可通过操纵初始流动相的疏水性质，控制溶质分子结合至反相介质的程度。虽然溶质分子的疏水性难以定量，但容易实现其疏水性质仅轻微变化的溶质的分离。因为其优良的分解能力，反相色谱是用于复杂生物分子高性能分离的不可缺少的技术。通常，初始使用从100%流动相A至100%流动相B的宽范围梯度实现反相分离。初始和最终流动相两者中有机修饰剂的量还可极大地变化。然而，有机修饰剂的常规百分数为在流动相A中5%或更少和在流动相B中95%或更多。反相色谱技术允许分离条件的巨大灵活性，使得研究人员可选择结合所关注的溶质，使污染物无延迟地通过柱，或结合污染物，使期望的溶质自由通过。通常，更合适的是结合所关注的溶质，因为脱附的溶质以浓缩状态从色谱介质洗脱。另外，因为在初始流动相条件下的结合是完全的，所以样品溶液中期望溶质的起始浓度不关键，允许稀释的样品施用于柱。反相色谱介质由化学接枝到多孔的不溶珠粒基体的疏水配体组成。基体必须在化学上和力学上都是稳定的。用于市售可得的反相介质的基础基体通常由二氧化硅或合成有机聚合物例如聚苯乙烯组成。当选择用于反相分离的缓冲条件时，pH是高度影响分离特性的参数之一。此外，也必须考虑靶分子的稳定性。因此，需要可在宽pH范围内(例如pH3-12)使用的反相色谱介质，以产生在选择最优pH方面的用户最大自由度。虽然由二氧化硅和聚苯乙烯制成的RPC介质在很多情况下功能令人满意，但它们不能在宽pH范围内使用。先前，在聚合(例如交联聚苯乙烯)载体上接枝苯乙烯，导致孔结构改变，已显示得到胰岛素分离方面的一定改善，见US7,048,858B2。聚苯乙烯在宽的pH范围内化学稳定，但与二氧化硅相比在许多pH值下遭受较差的选择性。另一方面，在大于~8的pH下长期使用期间，二氧化硅不稳定。因此，仍需要在宽pH范围内显示良好选择性的改进的RPC介质。专利技术概要本专利技术提供一种用于生产基于多孔碳水化合物颗粒的RPC材料的方法，所述RPC材料承受对机械强度的需求并在宽pH范围内得到高选择性。因此在第一方面，本专利技术提供一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，该方法包含以下步骤：在多孔碳水化合物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。多孔碳水化合物颗粒优选由多糖材料制成，最优选琼脂糖。琼脂糖先前成功地用于疏水相互作用色谱(HIC)，且许多商品是可得的，例如ButylSepharose本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，所述方法包含以下步骤：在多孔碳水化合物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.10 SE 1351198-51.一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，所述方法包含以下步骤：在多孔碳水化合
物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。
2.权利要求1的方法，其中所述多孔碳水化合物颗粒由多糖材料组成。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多孔碳水化合物颗粒由琼脂糖组成。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述不饱和基团为烯丙基。
5.权利要求4的方法，其中用烯丙基缩水甘油醚(AGE)进行烯丙基化。
6.上述权...

【专利技术属性】
技术研发人员：TE塞德曼，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE